Rezultate și discuții
Activarea constitutivă a factorului de transcripție NF-κB este considerată esențială pentru transformarea celulelor B de către proteina de fuziune API2-MALT1 a limfoamelor MALT cu o translocație t(11;18) . Supraexprimarea tranzitorie a API2-MALT1 în celulele 293T are ca rezultat activarea robustă a unei gene reporter de luciferază NF-κB , oferind astfel un sistem model util pentru studierea mecanismelor prin care API2-MALT1 transmite semnale către NF-κB. Pentru a monitoriza eficiența transfecției, am co-exprimat pEGFP-N2 (Clontech) într-o serie de experimente. Spre surprinderea noastră, am observat că EGFP a inhibat activarea NF-κB indusă de API2-MALT1 într-o manieră dependentă de doză (Fig. 1A). În schimb, EGFP nu a afectat activarea reporterilor indusă de expresia subunităților p50/p65 ale NF-κB (Fig 1B), sugerând o interferență cu cascada de semnalizare NF-κB activată de API2-MALT1 în amonte de NF-κB.
- slide PowerPoint
- imagine mai mare
- imagine originală
(A) Activarea unui reporter de luciferază NF-κB de către o proteină de fuziune API2-MALT1 marcată cu steag este inhibată de EGFP într-o manieră dependentă de doză.
(B) EGFP nu blochează activitatea luciferazei NF-κB dependentă de NF-κB indusă de expresia subunităților p50/p65 ale NF-κB (C) Activarea unui raportor NF-κB luciferază de către Flag-API2-MALT1 este inhibată de EGFP mutantă pentru motivul de legare TRAF6 (D) EGFP, dar nu și pmaxGFP, previne activarea indusă de TNF-α a unui reporter de luciferază NF-κB și fosforilarea IκB-α și JUN în celulele 293T.
EGFP nu crește nivelul HSP70 și nu induce HSP70B′ în celulele 293T.
Intensitățile de fluorescență (Ex485/Em520nm) pentru EGFP și pmaxGFP au fost ambele ∼100 de ori peste fond. (E) Proteinele de fuziune EGFP N- și/sau C-terminale (pentru API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actin, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) sau β-Tubulina) și EGFP cu un semnal de localizare nucleară (NLS) sau un situs de farnizilare (pEGFP-F) reduc activitatea reporterului de luciferază NF-κB indusă de TNF-α în celulele 293T. Jos: La om, HSP70 este exprimată constitutiv în condiții normale, dar Hsp70B′ este indusă numai ca răspuns la stres.
Nu există o expresie bazală a Hsp70B′.
Ca un control pozitiv pentru expresia HSP70B′, celulele 293T (banda 2) au fost supuse unui șoc termic la 44°C timp de două ore (banda 3) și au fost lăsate să se refacă la 37°C timp de 5 (banda 4) sau 18 (banda 5) ore înainte de recoltare. Activitatea luciferazei dependentă de NF-κB este reprezentată pentru fiecare experiment ca inducție fold a celulelor transfectate cu vector și este reprezentată grafic ca medie și abatere standard a cel puțin trei experimente independente.
Toate standardele de greutate moleculară sunt în kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 este o componentă esențială de semnalizare a căii antigen-receptor față de NF-κB , . Se crede că BCL10 mediază oligomerizarea MALT1, care permite formarea unui complex cu TRAF6. Oligomerizarea TRAF6 declanșează activitatea de ubiquitin ligază E3 a domeniului său RING, ceea ce duce la modificarea IKKγ (NEMO) prin intermediul lanțurilor de poliubiquitină legate de Lys63. Acest lucru facilitează apoi interacțiunea IKKγ cu kinaza de activare a TGFβ 1 (TAK1), care activează complet complexul kinazei IκB (IKK) prin fosforilarea IKKβ , ducând astfel la activarea NF-κB. În mod similar, proteina de fuziune API2-MALT1 activează NF-κB prin intermediul poliubiquitinării IKKγ , mediată de TRAF6. Interacțiunea lui TRAF6 cu extremitatea carboxi-terminală a MALT1 are loc prin intermediul a două motive potențiale de legare a TRAF6 (PxExxAr/Ac cu Ar/Ac pentru un reziduu aromatic sau acid . Inspectarea secvenței EGFP a evidențiat prezența unui consens de legare a TRAF6 (PNEKRD, AA 212-217). Structura cristalină a EGFP arată că motivul PNEKRD este expus într-o buclă între două foițe beta, sugerând accesibilitatea sa și un rol pentru EGFP ca regulator negativ prin sechestrarea TRAF6. Cu toate acestea, experimentele co-IP nu au reușit să demonstreze o interacțiune între EGFP și TRAF6 (datele nu sunt prezentate), iar mutanții pentru consensul de legare TRAF6 au blocat activarea NF-κB de către API2-MALT1 la fel de eficient ca și EGFP (Fig 1C).
Pentru a investiga dacă efectul a fost limitat la API2-MALT1, am analizat activarea NF-κB indusă de TNF-α în celulele 293T care exprimă EGFP. Din nou, EGFP a redus semnalizarea NF-κB, așa cum a fost demonstrat prin scăderea activității reporterilor și prin reducerea fosforilării inhibitorului NF-κB, IκB-α (Fig. 1D). În continuare, am evaluat dacă proteinele de fuziune EGFP ar putea avea același efect. Atât fuziunile EGFP N-terminale, cât și cele C-terminale au blocat activarea NF-κB indusă de API2-MALT1- (datele nu sunt prezentate) și TNFα (Fig. 1E). Pe lângă activarea căii NF-κB, tratamentul cu TNF-α declanșează, de asemenea, semnalizarea JNK. Fosforilarea lui JUN, indicativă pentru semnalizarea JNK activată, este redusă și de EGFP după tratamentul cu TNF-α (Fig 1D).
S-a raportat că vizualizarea prelungită a celulelor care exprimă GFP induce producerea de specii reactive de oxigen, ceea ce poate duce la modificări fiziologice și, în cele din urmă, la moartea celulelor . În mod interesant, ambii mutanți EGFP pentru consensul de legare TRAF6 și-au pierdut fluorescența verde, dar au inhibat eficient semnalizarea NF-κB (Fig 1C). Mai mult, pmaxGFP (Amaxa Biosystems), o proteină fluorescentă diferită din punct de vedere structural, nu a avut efect asupra activării NF-κB și JNK în urma tratamentului cu TNF-α (Fig. 1D), ceea ce sugerează că inhibiția nu a rezultat din fototoxicitatea asociată radicalilor liberi. Un alt studiu a indicat că nivelurile ridicate de EGFP pot induce proteina de șoc termic 70 (HSP70) , care este capabilă să inhibe activarea NF-κB prin interacțiunea sa cu IKKγ și TRAF6 . Cu toate acestea, inducerea HSP70 a fost limitată la celulele endoteliale și nu am observat niveluri crescute de HSP70 sau inducerea HSP70B′ în celulele 293T care exprimă EGFP (Fig. 1D-E).
Activarea NF-κB prin expresia API2-MALT1 sau la tratamentul cu TNF-α este asociată cu modificarea IKKγ cu polubiquitină legată de Lys63 de către TRAF6 sau, respectiv, TRAF2 , . În plus, semnalizarea JNK indusă de TNFα necesită autoubiquitinarea TRAF2 . Pentru a evalua un posibil efect al EGFP asupra activității de ubiquitin ligază RING E3 a TRAF6 sau TRAF2, am monitorizat ubiquitinarea prin intermediul unui mutant de ubiquitină marcat cu HA, cu numai Lys63 disponibil pentru polimerizare (HA-Ub-K63). Exprimarea API2-MALT1 sau stimularea TNF-α a crescut nivelul proteinelor polubiquitinate în celulele 293T și a fost asociată cu o polubiquitinare sporită a IKKγ în imunoprecipitate, iar ambele procese au fost blocate de EGFP (Fig 2A, benzile 1,2,5,6). Mai mult, EGFP a redus nivelul bazal de polubiquitinare legată de K63 în celulele 293T (Fig. 2A, benzile 3 și 4). În mod similar, expresia API2-MALT1 sau tratamentul cu TNFα stimulează asamblarea lanțului de ubiquitină legat de K48, care este din nou blocată de EGFP și de omologul său structural dsRed (Clontech), dar nu și de pmaxGFP (Fig 2B).
- slide PowerPoint
- imagine mai mare
- imagine originală
(A) Celulele 293T transfectate cu construcțiile indicate și tratate timp de 4 ore cu 20 ng/ml TNF-α (banda 5 și 6) au fost imunoblocate cu anticorpi anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) și anti-EGFP (panoul din stânga) sau imunoprecipitatele anti-IKKγ au fost imunoblocate cu anti-Flag (IKKγ) sau anti-HA (ubiquitină) (panoul din dreapta).
(B) EGFP afectează poliubiquitinarea legată de K48.
Celele 293T au fost transfectate cu o construcție de ubiquitină cu doar Lys48 disponibilă pentru polimerizare (HA-Ub-K48), tratate timp de 4 ore cu 20 ng/ml TNF-α sau lăsate netratate și lizatele celulare au fost imunoblocate cu anticorpi anti-HA (Ub-K48) și anti-EGFP.
Intensitățile de fluorescență (excitare 485/Emisie 520 nm) pentru EGFP și pmaxGFP au fost comparabile (∼100 ori mai mari decât valorile de fond), expresia pDs-Red a fost confirmată prin microscopie de fluorescență.
(C) EGFP stabilizează API2-Myc exogenă în celulele 293T prin reducerea autoubiquitinării sale legate de Lys48 și a degradării proteazomale.
(D) Expresia stabilă a EGFP în linia celulară de carcinom cu celule Merkel MCC14.2 reduce polubiquitinarea și sporește nivelurile de expresie a p53 endogenă.
Se indică raportul mediu și deviația standard a semnalelor p53 față de actină (trei experimente independente), (Ub)n : proteine polubiquitinate.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Pentru a investiga dacă EGFP afectează exclusiv ubiquitinarea de către proteinele TRAF, am evaluat API2, o ubiquitin ligază RING E3 care se destabilizează prin auto-ubiquitinare legată de Lys48 . Co-exprimarea EGFP a inhibat poliubiquitinarea indusă de API2 în celulele 293T, ceea ce a dus la o creștere a nivelurilor de expresie API2 (Fig. 2C). Niveluri reduse ale ubiquitinării la starea de echilibru au fost, de asemenea, observate în celulele MCC14.2 cu expresie stabilă a EGFP. În consecință, nivelurile bazale ale p53 endogen, care sunt strâns reglementate prin ubiquitinarea legată de Lys48 de către MDM2, sunt ușor crescute în celulele care exprimă EGFP (Fig 2D).
În continuare am examinat dacă EGFP afectează ubiquitinarea in vivo. Nivelurile bazale de poliubiquitinare au fost reduse în limfocitele splenice de la șoarecii transgenici EGFP , care a fost asociată cu o fosforilare redusă a IκB-α în urma stimulării cu antigen în comparație cu șoarecii de control, ceea ce indică faptul că EGFP reduce activarea NF-κB indusă de receptorul de celule B (Fig 3A-B). Șoarecii transgenici API2-MALT1 au un deficit de celule B B220+/CD40+ în măduva osoasă, deoarece activarea NF-κB mediată de API2-MALT1 accelerează maturizarea lor în celule B naive . Atunci când acești șoareci transgenici API2-MALT1 au fost încrucișați cu șoareci EGFP, deficitul de celule B B220+/CD40+ în măduva osoasă a șoarecilor dublu transgenici EGFP/API2-MALT1 (Fig. 3C) a fost restabilit, susținând în continuare un impact asupra ubiquitinării și semnalizării NF-κB in vivo. În mod similar, polubiquitinarea a fost redusă în celulele hepatice ale șoarecilor EGFP și a fost asociată cu stabilizarea p53, după cum arată creșterea nivelului de expresie a acesteia (Fig. 3A, D). Gena țintă majoră a p53 în cazul leziunilor ADN induse de γ-iradiere în ficat este p21, care este necesară pentru oprirea ciclului celular și repararea ADN-ului . În consecință, leziunile ADN induse de γ-iradiere au provocat nu numai un răspuns mai mare al p53 la șoarecii EGFP, dar și inducerea p21 a fost ușor îmbunătățită (Fig 3D). În cele din urmă, au fost efectuate experimente in vitro pentru a evalua dacă EGFP afectează în mod direct asamblarea lanțului de ubiquitină; cu toate acestea, EGFP recombinant nu a afectat polubiquitinarea unui substrat de control (Fig 3E), sugerând un efect al EGFP asupra ubiquitinării dependent de contextul celular.
- slide PowerPoint
- imagine mai mare
- imagine originală
(A) Western blot-uri ale extractelor de splină și ficat de la șoareci FVB de tip sălbatic (wt) și șoareci transgenici EGFP detectate cu anticorpi împotriva Ubiquitinei, EGFP și actinei (control de încărcare).
(B) EGFP reduce fosforilarea IκB-α în limfocitele B stimulate cu anti-IgM/anti-CD40, purificate de la șoareci EGFP.
Experimentele au fost efectuate în triplu exemplar, este prezentată o imagine reprezentativă a unui experiment.
Sunt indicate media și abaterile standard ale rapoartelor dintre IκB-α-P și actină în raport cu celulele nestimulate.
(C) Deficitul de celule B B220+/CD40+ din măduva osoasă a șoarecilor API2-MALT1 este restabilit la șoarecii dublu transgenici EGFP/API2-MALT1.
Experimentele efectuate în triplicat, sunt reprezentate media și abaterile standard. eMalt1: Malt1 endogen, banda specifică *a (D) Șoarecii EGFP prezintă niveluri crescute de p53 în ficat și au răspunsuri îmbunătățite la p53/p21 în cazul leziunilor ADN induse de γ-iradiere.
Sunt indicate media și abaterile standard ale rapoartelor dintre semnalele p53/p21 și actina în raport cu cel al probei 1.
(E) EGFP recombinat (rEGFP) nu împiedică polubiquitinarea unui substrat de Biotin-Lysozyme in vitro. (Ub)n: proteine poliubiquitinate.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
În concluzie, datele noastre indică faptul că EGFP și proteinele de fuziune EGFP afectează procesele dependente de RING E3 ubiquitin ligază, cum ar fi semnalizarea NF-κB și JNK sau homeostazia p53 în liniile celulare și la șoareci. NF-κB joacă un rol central în reglarea diverselor procese biologice, inclusiv a imunității înnăscute și adaptative, a dezvoltării, a creșterii și supraviețuirii celulare . Semnalele pro-supraviețuire rezultă din expresia crescută a inhibitorilor apoptozei, cum ar fi leucemia/limfomul cu celule B-XL. Prin urmare, creșterea apoptozei indusă de EGFP în celule sau în cortexul motor și striatum din creierul șoarecilor ar putea fi legată de activitatea redusă a NF-κB din cauza unei polubiquitinări defectuoase și a activării/degradării regulatorilor săi din amonte. Se presupune, de asemenea, că o ubiquitinare defectuoasă cauzează distrofia musculară a centurii membrelor, care este asociată cu mutații în Trim32, o ubiquitin ligază pentru actină . Deoarece s-a demonstrat că EGFP afectează interacțiunile actină-miozină în celulele musculare și induce cardiomiopatie dilatată la șoarecii EGFP , este tentant să se speculeze că ubiquitinarea actinei ar putea juca un rol esențial în funcționarea normală a mușchilor și că dereglarea acesteia de către EGFP provoacă fenotipurile menționate mai sus. Prin urmare, având în vedere rolul emergent al ubiquitinării în numeroase procese celulare, ar trebui să se analizeze cu atenție utilizarea EGFP ca raportor de celule vii.
.
Lasă un răspuns