O comparație între imunohistochimie și Western Blot

De Sarah Moore, M.Sc.Revizuit de Michael Greenwood, M.Sc.

Imunohistochimia și Western blotting funcționează amândouă prin exploatarea principiului modului în care anticorpii se leagă în mod specific de antigenele prezente în țesutul biologic.

Creditul imaginii: Sinitar/.com

Immunohistochimia este cea mai comună dintre tehnicile de imunomarcație. Aceasta vizualizează prezența antigenelor vizate în cadrul unei probe de țesut prin utilizarea anticorpilor care se atașează la antigeni, având un efect catalitic și divizând molecula în compuși identificabili. Vizualizarea acestei interacțiuni poate fi realizată prin utilizarea unei enzime (care produce un semnal cromogenic) sau a unui fluorofor (care creează un semnal fluorescent).

Western blot funcționează pe același principiu. Acesta a fost raportat pentru prima dată în anii 1970, când oamenii de știință l-au folosit pentru prima dată pentru a clasifica cu succes diferite proteine existente în țesuturile biologice. De atunci, s-au făcut progrese semnificative în tehnologie, ceea ce a dus la stabilirea tehnicii moderne de Western blot fluorescent, colorimetric și chemiluminiscent.

Toate versiunile metodei Western blot se bazează pe funcționarea complexului antigen-anticorp pentru a identifica proteinele specifice prezente într-o probă, indicate fie prin reacțiile enzimă-substrat ale moleculelor colorimetrice, chemiluminiscente sau fluorescente. Lumina produsă de aceste surse poate fi folosită pentru a deduce prezența și concentrația proteinelor într-o probă.

Compararea tehnicilor

În timp ce cele două metode se bazează pe principiul interacțiunii anticorp-antigen, există câteva diferențe majore între cele două tehnici. Mai jos, le prezentăm, pas cu pas.

În primul rând, pentru ambele tehnici, proba trebuie să fie pregătită corect. Pregătirea diferă destul de mult între cele două. Pentru imunohistochimie, probele de țesut sunt feliate sau lăsate întregi, în funcție de dimensiunea lor.

Limita pentru dimensiunea probelor variază, în general, între 3 µm și 5 µm. Apoi, probele sunt înglobate într-un mediu, de obicei ceară de parafină sau criomediu. După aceasta, feliile sunt așezate pe lame și deshidratate cu ajutorul unor spălări cu alcool de intensitate din ce în ce mai mare, în cele din urmă, încheindu-se cu adăugarea unui detergent pentru a limpezi proba, făcând-o gata pentru a fi vizualizată la microscop.

Pe de altă parte, Western blot necesită ca probele să fie mai întâi separate prin electroforeză și apoi imobilizate într-o membrană de blotting.

Metoda de colorare a probelor este, de asemenea, ușor diferită între cele două tehnici. Imunohistochimia adaugă fie anticorpi policlonali, fie monoclonali. Acești anticorpi sunt clasificați fie ca reactivi primari, fie ca reactivi secundari, primii fiind cei crescuți împotriva unui antigen țintă și sunt de obicei neconjugați, iar cei din urmă sunt conjugați cu o moleculă de legătură care apoi recrutează moleculele reporter.

Versiunea conjugată este utilizată într-o metodă de colorare directă, în care anticorpul reacționează direct cu antigenul din probă, versiunea neconjugată este utilizată într-o metodă de colorare indirectă, în care anticorpul nemarcat se leagă de antigenul țintă din țesut, determinând un anticorp secundar să reacționeze cu anticorpul primar.

În comparație, în metoda Western blot se adaugă un colorant fluorescent la probă, urmat de expunerea la o sursă de lumină cu lungimea de undă corespunzătoare pentru a excita moleculele de fluorofori.

După un anumit timp, fluoroforii excitați eliberează în cele din urmă energia pe care au obținut-o de la sursa de lumină pentru a reveni la starea lor fundamentală. Această eliberare de energie este ceea ce face ca fluoroforii să devină fluorescenți, emițând o sursă de lumină care poate fi captată de un aparat de imagistică digitală.

Compararea avantajelor și dezavantajelor

Principalul avantaj al imunohistochimiei este că metoda permite cercetătorilor să detecteze locația exactă a unei proteine țintă în cadrul unei probe de țesut. Acest avantaj principal a făcut ca ea să devină bine stabilită în domeniul neuroștiințelor ca metodă robustă de investigare a expresiei proteinelor în locațiile țintă din creier.

Pe de altă parte, metoda are un dezavantaj major în comparație cu metoda Western blot. Acesta constă în faptul că colorările nu sunt verificate în raport cu o scară de greutate moleculară, așa cum se întâmplă în cazul Western blot, ceea ce înseamnă că nu există nicio modalitate de a dovedi că colorarea prezentată în imunohistochimie este legată în mod concludent de o proteină specifică.

Metoda indirectă de imunohistochimie este recunoscută pentru că este foarte sensibilă, cu toate acestea, metoda directă este cunoscută pentru că este opusă și este, în general, incapabilă să detecteze concentrații mici de antigeni țintă.

Metoda Western blot este avantajoasă prin faptul că s-a impus ca o tehnică fiabilă pentru colectarea de date cantitative. Cu toate acestea, avantajul său cel mai proeminent este că s-a dovedit a fi eficientă în generarea unui semnal care este proporțional cu cantitatea de proteină existentă în probă.

De asemenea, metoda Western blot este adesea aleasă pentru capacitatea sa de a detecta simultan numeroase proteine țintă, având ca efect reducerea semnificativă a timpului de testare, precum și reducerea numărului de resurse necesare.

O diferență în aplicații

Există o mare suprapunere în aplicațiile celor două tehnici, având în vedere că sunt atât de asemănătoare. Cu toate acestea, în general, imunohistochimia se bazează mai ales pe imunohistochimie ca instrument de diagnostic pentru numeroase tipuri de cancer.

Metoda este utilizată pentru a identifica celulele anormale care sunt caracteristice anumitor tumori. Metoda este, de asemenea, utilizată pe scară largă pentru a identifica și localiza proteinele și biomarkerii care se găsesc atât în țesuturile normale, cât și în cele bolnave. În cele din urmă, este, de asemenea, utilizată în mod obișnuit pentru a detecta numeroase organisme infecțioase în țesuturi.

În comparație, Western blot este utilizat în principal pentru detectarea bolilor autoimune, a alergiilor și a bolilor infecțioase. Este utilizat pe scară largă în domeniile biologiei moleculare, biochimiei și biologiei celulare, aplicațiile sale cele mai notabile fiind folosite ca instrument de diagnostic pentru HIV și ESB.

Lecturi suplimentare

• Toate conținuturile de imunohistochimie
• Tehnici de imagistică în imunohistochimie (IHC)
• Imunohistochimie enzimatică (IHC)
• Imunohistochimie multicoloră (IHC)
• Cum funcționează imunochimia?

Scris de

Sarah Moore

După ce a studiat Psihologia și apoi Neuroștiința, Sarah și-a descoperit rapid plăcerea de a cerceta și scrie lucrări de cercetare; transformându-se într-o pasiune de a conecta ideile cu oamenii prin scris.

Citate

.