Molecular Identification of Mycobacterium Species of Public Health and Veterinary Importance from Cattle in the South State of Mexico

Abstract

Genul Mycobacterium cauzează o varietate de boli zoonotice. Cel mai cunoscut exemplu este tuberculoza zoonotică datorată M. bovis. Se știe mult mai puțin despre „micobacteriile non-tuberculoase (NTM)”, care sunt, de asemenea, asociate cu infecții la om. Standardul mexican NOM-ZOO-031-1995 reglementează prezența M. bovis la bovine; cu toate acestea, nu există nicio reglementare pentru speciile NTM. Obiectivul acestui studiu a fost de a izola și de a identifica speciile de micobacterii nontuberculoase de la bovinele din efectivele locale din regiunea sudică a statului Mexic prin identificarea și detectarea markerului molecular de 100 bp în gena ARNr 23S cu secvențierea ulterioară a genei ARNr 16S. Au fost colectate probe de lapte (35) și probe de exsudat nazal (68). Din cele 108 tulpini izolate, 39 au fost selectate pentru identificare. Treisprezece tulpini izolate din exudate nazale au amplificat markerul molecular de 100 bp și au fost identificate ca fiind M. neoaurum (șase tulpini), M. parafortuitum (patru tulpini), M. moriokaense (două tulpini) și M. confluentis (o tulpină). Cu excepția M. parafortuitum, celelalte specii identificate sunt de interes pentru sănătatea publică și veterinară, deoarece sunt patogene pentru oameni, în special pentru cei cu afecțiuni medicale subiacente.

1. Introducere

Genul Mycobacterium cauzează o mare varietate de boli zoonotice. Cel mai cunoscut exemplu este tuberculoza zoonotică cauzată de M. bovis, pentru care bovinele reprezintă principalul rezervor. M. bovis face parte din „complexul tuberculozei”, care include, de asemenea, speciile M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae și M. microti .

În cadrul grupului de micobacterii se află „micobacteriile nontuberculoase (NTM)”, care sunt, de asemenea, asociate cu infecții la om. NTM se găsesc în diverse surse din mediul înconjurător, cum ar fi solul, apa, vegetația, animalele, produsele lactate și fecalele și pot fi transmise din greșeală prin inhalare, ingestie sau penetrare cutanată .

Standardul mexican NOM-ZOO-031-1995 reglementează prezența M. bovis la bovine pentru a controla și eradica tuberculoza bovină (bTB); cu toate acestea, nu există nicio reglementare pentru speciile NTM. Diagnosticul oficial al tuberculozei bovine datorate prezenței M. bovis la nivel de teren se bazează pe testul intradermic cu ajutorul unui derivat proteic purificat (tuberculină) . Deși este utilizat de mai mulți ani, acest test nu oferă o sensibilitate și o specificitate bune. Aproximativ 20% dintre animalele cu tuberculoză nu reacționează la test , iar prezența altor specii de micobacterii, atât a celor din complexul tuberculozei, cât și a speciilor NTM, provoacă interferențe care duc la diagnostice fals pozitive și fals negative.

Deși Mexicul are un standard de reglementare, în unele zone se raportează o prevalență a bTB de peste 2% . Având în vedere specificitatea și sensibilitatea slabe ale testului la tuberculină, este probabil ca prezența reală a M. bovis să fie mai mică și, respectiv, este probabil ca rata de infectare a bovinelor cu alte micobacterii să fie mai mare. Astfel, crescătorii de bovine, medicii veterinari, tehnicienii și angajații care lucrează în industria zootehnică ar putea fi expuși din punct de vedere profesional la infecții cu M. bovis și NTM. Se cunosc foarte puține informații despre expunerea profesională la zoonozele datorate speciilor de NTM, deoarece identificarea acestor specii a fost o sarcină destul de dificilă înainte de dezvoltarea tehnicilor de identificare bazate pe biologia moleculară.

În prezent, tehnicile de biologie moleculară cel mai frecvent utilizate pentru diagnosticarea bolilor cauzate de micobacterii sunt polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție (RFLP) pentru diagnosticarea M. tuberculosis , spoligotiparea pentru diagnosticul M. bovis , și detectarea unei „inserții specifice” de 100 de perechi de baze (pb) localizate pe gena ARNr 23S caracteristică bacteriilor Gram-pozitive cu un conținut ridicat de guanină-citozină (HGC), care este considerată un marker molecular pentru acest grup de bacterii , urmată de analiza secvențială a genei ARNr 16S pentru identificarea bacteriilor la nivel de specie .

Printre speciile de NTM identificate prin tehnicile menționate mai sus se numără M. balnei, M. marinum și M. platypoecilus, care au provocat leziuni cutanate superficiale și profunde ; M. kansasii din leziuni pulmonare ; M. simiae din infecții generalizate ; M. kansasii din leziuni pulmonare ; M. simiae din infecții generalizate ; M. scrofulaceum din infecții ale pielii și ale organelor interne ; M. szulgai asociat cu infecții pulmonare, osteomielite, tenosinovite și limfadenite ; M. ulcerans asociat cu granuloame subcutanate ; M. fortuitum și M. chelonae asociate cu vasculită, endocardită, osteomielită, mediastinită, meningită, cheratită și hepatită ; M. abscessus, asociat cu leziuni eritematoase care au evoluat spre noduli ulcerați ; și alte specii.

Cel mai mare procent din inventarul de stat pentru capete de bovine din statul Mexic în Mexic este concentrat în regiunea sudică, iar una dintre principalele activități economice este creșterea vitelor . Regulamentul mexican pentru controlul bovinelor NOM-ZOO-031-1995 se axează doar pe testul de tuberculină pentru diagnosticarea M. bovis. Se cunosc puține informații despre prezența NTM la bovinele din regiune. Având în vedere posibilitatea identificării speciilor de actinobacterii prin detectarea markerului molecular de 100 de perechi de baze pe gena ARNr 23S și secvențierea ulterioară a genei ARNr 16S, este posibil să se identifice speciile de NTM menționate anterior.

Obiectivul prezentului studiu a fost de a izola și identifica speciile de NTM de la bovinele din regiunea de sud a statului Mexic. Speciile de Mycobacterium au fost izolate din probe de exudat nazal și lapte de bovine și au fost identificate prin detectarea markerului molecular de 100 de perechi de baze în gena ARNr 23S cu secvențierea ulterioară a genei ARNr 16S.

2. Materiale și metode

2.1. Eșantionare

S-a efectuat o eșantionare bazată pe distribuția spațială a turmelor pozitive la tuberculoza bovină în statul Mexic realizată de Zaragoza et al. 2015 . Au fost selectate patru turme de bovine din regiunea de sud a statului Mexic, o turmă aparținând municipalității Temascaltepec și trei turme aparținând municipalității Zacazonapan. Au fost colectate în total 103 probe, 35 de probe de lapte și 68 de probe de exudat nazal. Distribuția numărului și tipului de probe colectate în fiecare turmă este prezentată în tabelul 1.

2.2. Obținerea probelor de lapte și de exsudat nazal

Umerul și mameloanele au fost curățate cu apă purificată și săpun și apoi uscate cu prosoape de hârtie, iar ulterior s-a efectuat asepsia mameloanelor cu ajutorul unor tampoane îmbibate în alcool de 70%. Cinci mililitri de lapte au fost colectați direct din mamelon în vase sterile de 20 ml, aruncând fluxul inițial. Exsudatul nazal a fost colectat direct din interiorul orificiului nazal cu ajutorul unui tampon steril de 10 cm lungime, care a fost apoi scufundat într-o soluție salină izotonică (0,85%). Probele de lapte și exsudat nazal au fost păstrate la 4°C până la procesare.

2.3. Prelucrarea probelor

2.3.1. Izolarea micobacteriilor

Eșantioanele de lapte au fost centrifugate la 2500 de rotații pe minut (rpm) timp de 10 minute. Peletele din probele de lapte și exudat nazal au fost inoculate în următorul mediu de cultură selectiv pentru micobacterii: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) și Middlebrook (BD BBL 254521) suplimentat cu 6 g de piruvat de sodiu pe litru (Middlebrook-P). Mediile inoculate au fost incubate la 37°C timp de 8 săptămâni și au fost evaluate la fiecare 3 zile.

2.3.2. Clasificarea tulpinilor izolate

Dintre tulpinile izolate au fost distribuite în grupuri în funcție de următoarele caracteristici: pigmentarea coloniei, timpul de creștere și caracteristicile coloniei (formă, consistență, textură și producția de pigment). Tulpinile izolate au fost colorate cu Ziehl-Neelsen pentru a confirma prezența bacililor acido-rezistenți (AFB) .

2.4. Extracția ADN

S-au selectat pentru identificare tulpinile cu caracteristici microscopice similare cu micobacteriile (pozitivitate acid-fast) și două tulpini reprezentative din fiecare grup. Pentru a obține biomasă, tulpinile au fost inoculate în 30 ml de mediu de cultură lichid Middlebrook (BD BBL 254521) în flacoane de 125 ml și incubate la 37°C timp de 7 zile. Mediul lichid a fost transferat în tuburi Falcon sterile de 15 ml și centrifugat timp de 15 minute la 14.000 rpm. Apoi, supernatantul a fost îndepărtat, iar peletul a fost transferat în tuburi Eppendorf de 1,5 ml; tuburile au fost apoi centrifugate la 14.000 rpm × 5 minute, iar supernatantul a fost aruncat. Extracția de ADN a fost efectuată pe peletul rezultat cu ajutorul kitului Wizard Genomic DNA Purification (Promega A1120).

2.5. Detectarea markerului molecular în gena ARNr 23S

Markerul molecular de 100 bp situat pe gena ARNr 23S a fost amplificat conform metodologiei descrise de Roller et al. (1992) folosind următorii primeri: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, și 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

Reacția a fost realizată folosind o ADN polimerază Taq comercială (Promega M1661). Au fost utilizate următoarele condiții de ciclu termic: o etapă de predenaturare timp de 5 minute (94°C); 29 de cicluri de denaturare timp de 30 de secunde (94°C), hibridizare timp de 45 de secunde (46°C) și alungire timp de 50 de secunde (72°C); și, în final, un ciclu de postelongare de 5 minute (72°C). Fragmentele amplificate au fost confirmate pe un gel de agaroză 2% colorat cu bromură de etidiu (SIGMA 46065).

2.6. Amplificarea genei ARNr 16S

Străinele care au amplificat markerul filogenetic de 100 bp au fost selectate pentru analiza secvențială a ARNr 16S. Pentru amplificare au fost utilizați următorii amorsere: 8f: AGAGTTTTGATCMTGGCTCAG și 1492r: TACGGYTACCTCTTGTTACGACTT.

Reacția a fost realizată cu ajutorul unei ADN polimeraze Taq comerciale (Promega M1661). Au fost utilizate următoarele condiții de ciclu termic: o etapă de predenaturare timp de 5 minute (94°C); 34 de cicluri de denaturare timp de 30 de secunde (94°C), hibridizare timp de 20 de secunde (52°C) și alungire timp de 1 minut și 30 de secunde (72°C); și, în final, un ciclu de postelongare de 7 minute (72°C).

Fragmentele amplificate au fost confirmate pe un gel de agaroză 1% colorat cu bromură de etidiu (SIGMA 46065). Produșii acestei amplificări au fost purificați cu ajutorul kitului Amicon Ultra Filter® (Millipore UFC901008) și confirmați pe un gel de agaroză 1% pentru a se verifica prezența și calitatea lor.

2.7. Identificarea speciilor de Mycobacterium

Produsele amplificate ale genei ARNr 16S au fost trimise la Macrogen Sequencing Service, Maryland, SUA. Secvențele obținute au fost analizate și corectate cu ajutorul programului BioEdit . Secvențele consensuale au fost construite din fragmentele forward și reverse, care au fost comparate cu secvențele depuse anterior în GenBank al National Center for Biotechnology Information (NCBI) folosind programul BLAST și EzTaxon 2.1 .

2.8. Analiză filogenetică

Secvențele genei 16S ARNr au fost obținute pentru următoarele specii de micobacterii de la American Type Culture Collection (ATCC) și de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , și M. confluentis . Secvențele tulpinilor din colecție și cele ale tulpinilor izolate în prezenta investigație au fost aliniate cu programul BioEdit . Analiza filogenetică a fost efectuată utilizând metoda parsimoniei maxime în software-ul MEGA versiunea 4 . Pentru a forma rădăcina cladogramei, a fost utilizată secvența Pantoea agglomerans DSM 3493.

3. Rezultate

Cele 108 tulpini izolate din cele 103 probe colectate au fost distribuite în 13 grupe în funcție de caracteristicile lor morfologice macroscopice și microscopice (tabelul 2). Grupele 11 și 12, în special, au fost alcătuite din tulpini acid-fast.

Pentru identificarea la nivel de specie, au fost alese 39 de tulpini: 10 dintre ele aparțin grupului 11 și 7 grupului 12. Pentru a completa cele 39 de tulpini au fost selectate câte două tulpini din fiecare dintre cele 11 grupuri rămase. Markerul molecular de 100 bp a fost găsit la 33% (13/39) din tulpinile selectate. Pentru acestea, gena ARNr 16S a fost amplificată pentru secvențiere și identificare la nivel de specie.

Prevalența globală a NTM pe probele colectate a fost de 12,6% (13/103), luând în considerare atât probele de lapte, cât și cele de exsudat nazal. Cu toate acestea, prevalența specifică pentru probele de exsudat nazal a fost de 19,1% (13/68).

Conform comparației secvențelor, au fost identificate patru specii de NTM din genul Mycobacterium; 64% (6/13) dintre tulpini au avut 98% și 99% de similarități cu M. neoaurum, în timp ce 31% (4/13) au avut o similitudine de 99% cu M. parafortuitum, 15% (2/13) au avut similitudini de 98% și 99% cu M. moriokaense și, în sfârșit, 8% (1/13) au avut o similitudine de 99% cu M. confluentis (tabelul 3).

Arborele filogenetic a fost format cu genul Mycobacterium și patru dintre speciile sale, prin care au fost observate relațiile filogenetice dintre tulpinile din colecție și tulpinile izolate în prezenta investigație (Figura 1).

Figura 1

Arbore filogenetic construit prin compararea secvențelor genei ARNr 16S de la tulpinile izolate și cele de referință.

4. Discuții

Speciile de NTM au fost izolate numai din probe de exudat nazal, ceea ce a eliminat probele de la una dintre fermele locale din acest studiu (tabelul 1). Am constatat că prevalența specifică a fost de 19,1% în efectivele din regiunea de sud a statului Mexic. Studii similare din Statele Unite, Africa de Sud, Tanzania și Brazilia au raportat valori ale prevalenței NTM de 3,4 %, 24,5 %, 7 % și, respectiv, 7,8 %; prin urmare, valoarea prevalenței constatată în acest studiu se încadrează în intervalul raportat anterior . În acest studiu, 13 din cele 39 de tulpini analizate au fost identificate ca fiind speciile NTM M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis și M. parafortuitum.

M. neoaurum, un membru al complexului Mycobacterium parafortuitum, este responsabil pentru un spectru larg de boli, majoritatea infecțiilor legate de dispozitive, cum ar fi cateterele Hickman, cateterele BROVIAC, liniile PICC , fistulele arteriovenoase care au inclus o grefă de politetrafluoretilenă , pace makerii și endocardita valvei protetice . Pacienții imunocompromiși care dețin aceste dispozitive sunt gazdele principale, de exemplu, pacienții care suferă de cancer și diabeticii cu insuficiență renală și probleme cardiace . M. neoaurum a fost izolat, de asemenea, de la pacienți cu infecții urinare , meningoencefalită și alterări ale sistemului nervos central , bacteriemie și endocardită , și infecție pulmonară . Deși a fost izolat în principal din cazuri clinice, există, de asemenea, rapoarte despre izolarea sa din lapte și bovine .

M. moriokaense a fost izolat din proba de spută . Deși este considerată nepatogenă pentru oameni, a fost asociată cu boli pulmonare . M. confluentis a fost izolat și el din probe de spută , și, împreună cu M. parafortuitum, ambele sunt considerate specii nepatogene. M. confluentis, M. moriokaense și M. neoaurum au fost izolate din diferite țesuturi de bovine și animale sălbatice cu leziuni tuberculoase, în timp ce M. parafortuitum a fost izolat doar din laptele de bovine . Cu toate acestea, în lucrarea noastră, M. parafortuitum a fost izolat doar din probe de exsudat nazal.

Exigențele nutriționale ale micobacteriilor diferă între diferitele specii, acesta fiind motivul pentru care s-au folosit medii de cultură diferite. În special, șapte dintre cele 13 tulpini identificate în acest studiu au fost izolate în mediul Stonebrink, inclusiv M. neoaurum, M. parafortuitum și M. moriokaense. Acest rezultat este în concordanță cu cel descris de Sepúlveda et al. care au indicat că mediul Stonebrink este potrivit pentru recuperarea diferitelor specii din genul Mycobacterium. García-Martos și García-Agudo au raportat că mediul Middlebrook este optim pentru izolarea actinomicetelor, ceea ce este în concordanță cu prezenta investigație, având în vedere că două specii, M. neoaurum și M. parafortuitum, au fost izolate în acest mediu. În special, M. confluentis a fost izolat numai în mediul Middlebrook suplimentat cu piruvat de sodiu; astfel, strategia de utilizare a diferitelor medii de cultură a fost adecvată deoarece a permis izolarea diferitelor specii din genul Mycobacterium.

Dezvăluirea markerului molecular prezent în gena 23S ARNr a bacteriilor Gram-pozitive cu conținut de HGC a permis discriminarea între tulpinile de eubacterii și micobacterii. Analiza de secvențiere a genei ARNr 16S a făcut posibilă identificarea la nivel de specie; prin urmare, combinația acestor metodologii este adecvată pentru identificarea speciilor de NTM.

5. Concluzii

Utilizând metodologia descrisă în acest studiu, au fost izolate și identificate patru specii de NTM: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum și M. parafortuitum. Aceste specii au fost izolate pentru prima dată din exsudate nazale ale bovinelor din regiunea sudică a statului Mexic. Trei dintre speciile identificate (M. neoaurum, M. moriokaense și M. confluentis) sunt importante din punct de vedere veterinar și al sănătății publice.

Divulgare

Această lucrare derivă din teza pentru obținerea titlului de doctor în Științe ale Sănătății (Universidad Autónoma del Estado de México), înregistrată în PNPC-CONACYT.

Conflicte de interese

Toți autorii declară că nu au conflicte de interese.

Recunoștințe

Autorii doresc să recunoască asistența financiară acordată de Secretariatul de Cercetare și Studii Avansate al Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) prin intermediul următoarelor granturi de cercetare: (i) „Implementarea sistemelor de informații geografice și a tehnicilor de biologie moleculară, ca instrumente de detectare și identificare a Mycobacterium spp.”, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, și (ii) rețeaua „Microbiología y química en las Ciencias de la Salud”, 039/2014RIF.

.