Rezultate
Pentru a găsi lungimea de undă maximă de emisie pentru a monitoriza intensitatea fluorescenței AMC după scindarea tripsinei, au fost măsurate spectrele de excitație și de emisie, care sunt prezentate în figura 1. S-a constatat că lungimea de undă maximă de emisie este de 440 nm.
Pentru a standardiza intensitatea fluorescenței măsurate a soluției de enzimă la concentrația de AMC izolată, s-a efectuat o titrare și s-a măsurat fluorescența. La o soluție de enzimă de 2,5 ml s-a adăugat o cantitate de 0,5 ml dintr-o soluție de AMC de 50 µmol/L, iar concentrațiile inițiale și finale de AMC izolat sunt rezumate în tabelul 1.
Tabelul 1. Concentrațiile de AMC izolate înainte și după standardizarea intensității fluorescenței.
| Concentrație inițială | 3 | 6 | 15 | 30 | 60 | 120 | 240 | |
| Concentrație finală | 0.5 | 1 | 2,5 | 5 | 10 | 20 | 40 |
Cinetica activității tripsinei a fost apoi obținută prin măsurarea intensității de fluorescență a AMC izolate la scindarea tripsinei din substrat. Figura 2 prezintă măsurarea cursului timpului după ce 0,5 ml de concentrații variabile ale soluției de substrat Boc-Gln-Ala-Arg-MCA au fost adăugate la 2,5 ml de soluție enzimatică.
Utilizând programul Kinetics Analysis, s-a trasat un grafic Lineweaver-Burk (figura 3) din măsurătorile de fluorescență în timp din figura 2. Graficul Lineweaver-Burk furnizează parametrii cinetici ai enzimei, cum ar fi rata maximă a reacției, Vmax, și constanta Michaelis-Menten, Km. Vmax descrie viteza de reacție atunci când enzima este saturată cu substrat, în timp ce Km indică cantitatea de substrat pentru a atinge viteza maximă de reacție. Vmax a fost de 35,270 nmol/L-min-1 , iar Km a fost de 5,99. Ecuația liniei a fost 1/v = 0,000270 – 1/ + 0,0000284.
.
Lasă un răspuns