Metode, tehnici și protocoale de imunocitochimie

Pagina principală a CIC >Fixarea celulelor

Pentru a asigura accesul liber al anticorpului la antigenul său, celulele trebuie fixate și permeabilizate. În general, intensitățile și timpii de fixare sunt considerabil mai scurte pentru celule decât pe secțiunile de țesut mai groase și mai complexe din punct de vedere structural. Pentru imunocitochimie, pregătirea probei presupune, în esență, fixarea celulelor țintă pe lamă. O fixare perfectă ar imobiliza antigenele, păstrând în același timp arhitectura celulară și subcelulară autentică și permițând accesul neîngrădit al anticorpilor la toate celulele și compartimentele subcelulare. Se utilizează în mod obișnuit o gamă largă de fixatori, iar alegerea corectă a metodei va depinde de natura antigenului examinat și de proprietățile anticorpului utilizat. Metodele de fixare se împart, în general, în două clase: solvenți organici și reactivi de reticulare. Solvenții organici, cum ar fi alcoolii și acetona, elimină lipidele și deshidratează celulele, precipitând în același timp proteinele de pe arhitectura celulară. Reactivii de reticulare (cum ar fi paraformaldehida) formează punți intermoleculare, în mod normal prin intermediul grupărilor amino libere, creând astfel o rețea de antigene legate. Reactanții de reticulare păstrează structura celulară mai bine decât solvenții organici, dar pot reduce antigenitatea unor componente celulare și necesită adăugarea unei etape de permeabilizare, pentru a permite accesul anticorpilor la specimen. Fixarea cu ambele metode poate denatura antigenii proteici și, din acest motiv, anticorpii preparați împotriva proteinelor denaturate pot fi mai utili pentru colorarea celulelor. Sunt descrise diferite metode de fixare. Metoda de fixare adecvată trebuie aleasă în funcție de aplicația relevantă.

1. Fixarea cu acetonă

  • Fixați celulele în acetonă la -20°C timp de 5-10 minute.

  • Nu este necesară o etapă de permeabilizare după fixarea cu acetonă.

2. Fixarea cu metanol

  • Fixați celulele în metanol la -20°C timp de 5-10 minute.

  • Nu este necesară o etapă de permeabilizare după fixarea în metanol.

3. Fixarea în etanol

  • Fixați celulele în etanol 95% răcit, 5% acid acetic glacial timp de 5-10 minute.

4. Fixare metanol-acetonă

  • Fixați în metanol răcit, 10 minute la -20 °C.

  • Îndepărtați excesul de metanol.

  • Permeabilizați cu acetonă răcită timp de 1 minut la -20 °C.

5. Fixarea amestecului metanol-acetonă

  • Mestec de metanol și acetonă 1:1.

  • Faceți amestecul proaspăt și fixați celulele la -20 C timp de 5-10 minute.

6. Fixarea amestecului metanol-etanol

  • Mestec 1:1 de metanol și etanol.

  • Faceți amestecul proaspăt și fixați celulele la -20 C timp de 5-10 minute.

7. Fixarea cu formalină

  • Fixați celulele în formalină tamponată neutră 10% timp de 5-10 minute.

  • Rezolvați scurt cu PBS.

  • Permeabilizați cu 0,5% Triton X-100 timp de 10 minute.

8. Fixarea cu paraformaldehidă-Triton

  • Fixați în 3-4% paraformaldehidă timp de 10-20 minute.

  • Rezolvați scurt cu PBS.

  • Permeabilizați cu 0,5% Triton X-100 timp de 10 minute.

9. Fixare cu paraformaldehidă și metanol

  • Fixare în paraformaldehidă 4% timp de 10-20 minute.

  • Se clătește scurt cu PBS.

  • Se permeabilizează cu metanol răcit timp de 5-10 minute la -20 °C.

.