Imunoanaliză rapidă în flux lateral pentru detectarea prin fluorescență a ARN-ului SARS-CoV-2

În sistemul HC-FIA, FNP-urile funcționalizate cu ADN de sondă amplifică semnalul de hibridizare a ARN-ului viral și a ADN-ului din sondă. Principiul de proiectare al biosenzorului HC-FIA este prezentat în Fig. 1.

a, Principiul HC-FIA. b, Rezultate reprezentative pe o bandă de curgere laterală. c, Dispozitivul de analiză prin fluorescență. d, O fotografie a laboratorului valiză portabilă, care are o lungime de 55,5 cm, o lățime de 37 cm și o înălțime de 23 cm, cu o greutate de 8,5 kg. e, Procesul de testare a testului HC-FIA. Etapa 1: hibridizarea acidului nucleic într-un incubator la temperatură constantă. Etapa 2: determinarea intensității semnalelor de fluorescență de pe cardul de testare cu ajutorul dispozitivului prezentat la litera c. f, Distribuția sondei în genomul SARS-CoV-2.

Concepția și funcționarea testului HC-FIA

She murine S9.6 anticorpi monoclonali sunt prefixați pe linia de testare (T) a benzii de curgere laterală, iar linia de control (C) este acoperită cu anticorpi policlonali IgG de capră anti-rabie de iepure (Fig. 1a). FNP marcate cu anticorpi S9.6 și IgG de iepure se introduc în tubul de reacție. La începutul procesului de detecție, SARS-CoV-2 din proba de tampon de gât sau de spută este lizat și eliberat, iar ARN-ul eliberat se hibridizează cu sonda ADN specifică SARS-CoV-2. Hibridul ARN-ADN rezultat este capturat de anticorpii S9.6 marcați cu FNP, iar complexul curge de-a lungul plăcuței de probă și a membranei de nitroceluloză spre hârtia absorbantă sub acțiunea forțelor capilare. La trecerea prin zona T, complexul este capturat de anticorpii S9.6, generând treptat un semnal fluorescent. În zona C, IgG de iepure marcată cu FNP este captată de IgG de iepure anti-rabbit. Prezența sau absența ARN-ului țintă SARS-CoV-2 se bazează pe o valoare limită pentru intensitatea fluorescenței (Fig. 1b,c). Figura 1d prezintă un laborator portabil cu valiză care are capacitatea de a furniza rezultate calitative în mai puțin de o oră după următoarele două etape: hibridizare și analiză prin imunofluorescență (Fig. 1e).

Aici am folosit raportul dintre semnalul de fluorescență al testului și semnalul de fluorescență al controlului (T/C) pe banda de flux lateral, astfel încât influența oricărei fluorescențe de fond a cardului de test să fie redusă la minimum. Măsurând raportul T/C al probelor de tampoane de gât de la 211 indivizi sănătoși, am constatat că raportul mediu T/C de fond a fost de 49,95, cu o deviație de 17,16 (Fig. suplimentară 1a). Curba caracteristică de funcționare a receptorului (ROC) și aria de sub curbă (AUC) au fost utilizate pentru a determina valoarea de prag și pentru a evalua acuratețea de diagnosticare a testului HC-FIA pe baza sensibilității și specificității la diferite praguri. Am determinat o curbă ROC cu o AUC de 0,999 cu un interval de încredere (IC) de 95 % de 0,997-1,000 (Fig. suplimentară 1b) folosind probe de tampoane de gât de la 100 de cazuri COVID-19 confirmate clinic și excluse. Valoarea cut-off care a obținut cea mai mare sensibilitate și specificitate a fost determinată ca fiind de 102,07, corespunzând punctului indicelui Youden de 0,980. Alternativ, o valoare de prag de două ori mai mare decât valoarea fondului negativ (în acest caz, 49,95 × 2 = 99,90) este de obicei utilizată ca valoare limită în imunoanalize. Pentru comoditate, am ales o valoare de prag T/C de 100,00.

Dezvoltarea testelor HC-FIA

Optimizarea sondelor ADN pentru secvența ARN țintă a SARS-CoV-2 este esențială pentru îmbunătățirea eficienței testelor. O listă a tuturor secvențelor de sonde ADN pe care le-am conceput este furnizată în tabelul suplimentar 1. Genomul SARS-CoV-2 cuprinde aproximativ 30 000 de baze, inclusiv un număr variabil (6-11) de cadre de lectură deschise (ORF). Primul ORF reprezintă aproximativ 67 % din întregul genom și codifică 16 proteine nestructurale, precum și proteine ajutătoare și proteine structurale. Cele patru proteine structurale principale sunt glicoproteina spike (S), proteina mică a învelișului (E), proteina matricei (M) și proteina nucleocapsidă (N)15,16. Majoritatea testelor de detectare a acizilor nucleici pentru SARS-CoV-2 utilizează următoarele trei regiuni conservate din genomul viral: ORF1ab, în care este localizată gena polimerazei dependente de ARN (rdrp)15, și regiunile care codifică N și E.

Am început prin a prelua secvența genomului ARN al SARS-CoV-2 de la National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (numere de acces, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 și NC_045512.1). O analiză detaliată a altor secvențe publicate pentru genomul SARS-CoV-2 nu a relevat nicio variație notabilă în aceste regiuni. Cu ajutorul software-ului de proiectare Primer Premier 5.0, am proiectat trei sonde pentru fiecare dintre cele trei regiuni: CoV01 și CoV04, situate în regiunea recomandată pentru detectarea ORF1ab și, respectiv, N; și CoV08, în aceeași regiune ca și E17. Pozițiile genomice ale situsurilor de legare a sondei în secvența genomului de referință (NC_045512.2) sunt indicate în Fig. 1f.

Alinierea secvențelor a fost realizată între sondele de ADN proiectate și secvențe din genomul uman și din genomurile de virusuri, bacterii, micoplasme, chlamydia și alți agenți patogeni comuni. Sondele se potriveau doar cu secvența genomică a SARS-CoV-2 și nu am găsit nicio homologie cu ADN-ul genomic uman. Pseudovirusurile purtătoare de diferite regiuni ale genei țintă construite cu ajutorul lentivirusurilor ca vectori au fost utilizate ca martori pozitivi. Secvențele genei țintă ale pseudovirusurilor utilizate sunt prezentate în tabelul suplimentar 2. P1 a fost pozitiv pentru regiunea N a SARS-CoV-2, P2 pentru regiunea E a SARS-CoV-2 și P3 pentru regiunea ORF1ab a SARS-CoV-2. Concentrația celor trei controale pozitive a fost de 3 000 de unități de transducție (TU) ml-1, ceea ce indică faptul că existau 3 000 de particule virale infecțioase pe ml. Soluția salină fiziologică, apa purificată și probele de tampoane faringiene pozitive pentru alți agenți patogeni comuni au fost utilizate ca martori negativi ai N1-N17. O listă de informații despre referințele pozitive și negative utilizate în cadrul studiului este furnizată în tabelul suplimentar 3. Rezultatele testelor sunt prezentate în tabelele suplimentare 4-6. Pentru regiunea ORF1ab, au fost selectate sondele CoV01 și CoV03; pentru regiunea E, a fost selectată sonda CoV08; iar pentru regiunea N, sondele CoV04 și CoV06 s-au legat în mod preferențial la ARN-ul țintă. Sondele de ADN selectate au fost optimizate în continuare prin combinare (tabelul suplimentar 7), fiecare grup de sonde vizând simultan toate cele trei segmente. Rezultatele testului HC-FIA din tabelul suplimentar 8 arată că combinația sondelor Cov01, Cov04 și Cov08 (grupul 2) a discriminat între toate probele de control pozitive și controalele negative și a detectat probele pozitive cu un titlu viral scăzut (1 000 TU ml-1; tabelul suplimentar 3, L1-L3) la o rată de pozitivitate de peste 95 %. Prin urmare, grupul 2 a fost selectat ca fiind combinația finală. Până în prezent, există 13 411 secvențe de nucleotide SARS-CoV-2 publicate pe NCBI. Alinierea celor trei sonde cu regiunea țintă corespunzătoare din cele 13.411 secvențe încărcate a arătat că regiunile țintă ale sondelor au fost suficient de conservate pentru a produce o similitudine de 100%.

Am optimizat, de asemenea, condițiile de testare a testului, în special timpul de incubare pentru hibridizare și timpul de citire a benzii de testare. Performanțele testului pentru timpii de incubație de 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min și 60 min la 56 °C sunt prezentate în tabelul suplimentar 9. Rețineți că 20 min au fost suficiente pentru ca sondele de ADN să se hibridizeze cu regiunea țintă, ceea ce a fost reflectat de rata pozitivă de 100 % în detectarea probelor pozitive de tampoane de gât și de spută cu titru viral scăzut (1 000 TU ml-1; tabelul suplimentar 3, L1-L3). Atunci când timpul de incubație a fost prelungit la 50 sau 60 de minute, reacția nu a fost la fel de stabilă, deoarece rata de pozitivitate a probelor de referință L1-L3 a scăzut. Luând în considerare eficiența detecției și cerința de inactivare a virusului, am selectat 30 min ca timp de incubare pentru hibridizare la 56 °C. Am evaluat, de asemenea, timpul de citire a benzii pentru valorile 10 min, 12 min, 15 min și 18 min (tabelul suplimentar 10). Rezultatele au indicat că 12 min sau mai mult au condus la detectarea corectă a probelor de referință pozitive și negative. Cu toate acestea, coeficientul de variație (CV) a fost mai mic de 10 % pentru detectarea probelor pozitive cu un titru viral scăzut numai atunci când s-a utilizat un timp de citire de 15 min. Prin urmare, am selectat un timp de citire de 15 min.

Tiocianatul de guanidiniu și clorura de guanidină – cei mai utilizați denaturanți proteici pentru extracția de acid nucleic – au fost comparate ca medii de transport pentru conservarea probelor. Tiocianatul de guanidiniu a condus la o performanță mai bună la discriminarea între probele pozitive și negative, cu un CV relativ scăzut pentru probele cu un titlu viral scăzut. De fapt, tiocianatul de guanidiniu la o concentrație de până la 6 mol l-1 a demonstrat proprietăți antivirale excelente18. Am selectat tiocianatul de guanidiniu la o concentrație de 5 mol l-1 ca denaturant proteic pentru inactivarea virală în mediul de transport.

Specificitatea testului HC-FIA

După optimizarea secvențelor de sondă și a condițiilor de reacție, am examinat specificitatea testului HC-FIA pentru detectarea SARS-CoV-2. Controalele pozitive au inclus pseudovirusuri (probele P1-P3) cu gene țintă și cinci probe clinice de tampoane de gât (probele P4-P8), confirmate cu ajutorul unui kit de detectare a acidului nucleic bazat pe RT-qPCR (Shanghai ZJ Bio-Tech). Controalele negative, care au constat în probe de tampoane de gât, au fost confirmate ca fiind negative pentru SARS-CoV-2 și pozitive pentru gripa A, gripa B, virusul sincițial respirator, chlamydia pneumoniae, adenovirus sau alți agenți patogeni (probele N5-N17), sau pseudovirus-pozitive pentru regiunea N a MERS (proba N18) sau SARS (proba N19). O listă a tuturor eșantioanelor este furnizată în tabelul suplimentar 3. O listă a rezultatelor detecției a 8 probe de referință pozitive și a 15 probe de referință negative este furnizată în tabelul suplimentar 11.

Am investigat dacă a existat o reactivitate încrucișată între SARS-CoV-2 și 55 de agenți patogeni comuni care provoacă boli respiratorii. Sursa și informațiile cantitative ale fiecărui microorganism patogen sunt furnizate în Setul de date suplimentar 1. Titlul inițial al virusului a fost determinat ca fiind de 106 unități formatoare de plăci pe ml cu ajutorul unui test de placă. Pentru probele de interferență de bacterii, micoplasmă și chlamydia, nivelul de concentrație a fost de 107 unități formatoare de colonii pe ml. În plus, ADN genomic uman a fost extras și cuantificat ca fiind de 90-105 µg ml-1 din trei probe de sânge integral. Testul HC-FIA a prezentat o specificitate excelentă pentru SARS-CoV-2, fără reactivitate încrucișată evidentă cu toate celelalte probe de agenți patogeni și cu ADN genomic uman (Set de date suplimentar 1).

Deoarece anticorpul monoclonal S9.6 se leagă, de asemenea, de duplexurile ARN-ARN19, în special de cele bogate în UA20, am proiectat secvențe de ARN bicatenar cu fracții variabile de UA. Informații detaliate privind secvențele sunt furnizate în tabelul suplimentar 12. După cum se arată în tabelul suplimentar 13, indiferent de conținutul de UA, testul HC-FIA nu a prezentat un semnal pozitiv detectabil față de ARN bicatenar, ceea ce indică faptul că există o afinitate de legare scăzută între anticorpul S9.6 și ARN bicatenar în condițiile de testare. Am investigat, de asemenea, dacă prezența ARN-ului bicatenar afectează performanța testului în detectarea probelor clinice de tampoane de gât sau de spută. Am utilizat 2 probe pozitive de tampoane de gât, 2 probe pozitive de spută, 10 probe negative de tampoane de gât și 5 probe negative de spută. Am măsurat rapoartele T/C în raport cu valorile T/C ale testului fără interferențe și am constatat că aceste rapoarte au variat între 0,9 și 1,1 (Set de date suplimentar 1). Acest lucru indică faptul că prezența ARN-ului bicatenar, indiferent de conținutul de UA, nu afectează în mod semnificativ performanța testului HC-FIA.

Sensibilitatea și precizia testului HC-FIA

Am diluat în serie probele de pseudovirus care conțin trei secțiuni de gene țintă la titluri de 5.000, 2.500, 1.000, 1.000, 800, 500, 250 și 100 TU ml-1, și am calculat valorile medii T/C pentru 20 de teste paralele. Figura 2a arată că valorile limitei de detecție (LOD) a pseudovirusurilor pozitive pentru regiunile N, E sau ORF1ab ale SARS-CoV-2 au fost de până la 1.000 TU ml-1, cu o rată de pozitivitate mai mare de 95%. Atunci când titlurile probelor de pseudovirus au ajuns la 108 TU ml-1, nu s-a observat niciun efect de cârlig notabil (Fig. suplimentară 2). Intervalul liniar al testului corespunde titlurilor cuprinse între 103 și 106 sau 107 TU ml-1.

Axele verticale arată raportul fluorescență-intensitate (T/C) al semnalului de test (T) și al semnalului de control (C). Pentru fiecare concentrație, s-au efectuat 20 de teste în paralel. LOD a fost determinat ca fiind concentrația la care rata de pozitivitate a fost mai mare sau egală cu 95%. a, Rapoarte T/C pentru eșantioane de pseudovirus diluate în serie, pozitive pentru regiunile N, E și ORF1ab ale SARS-CoV-2. b, Rapoarte T/C pentru eșantioane de tampoane de gât diluate în serie de la trei pacienți în stare critică. Datele sunt medii ± s.d.

Eșantioanele de tampoane de gât de la trei pacienți grav bolnavi – pentru care s-a stabilit că sunt pozitive pentru SARS-CoV-2 prin RT-qPCR, iar încărcăturile virale au fost cuantificate prin PCR digitală – au fost amestecate cu eșantioane de tampoane de gât negative pentru a pregăti diluții în serie de 2.000, 1.000, 500, 400 și 250 de copii pe ml. După cum se arată în Fig. 2b, LOD a fost de 500 de copii pe ml, cu o rată pozitivă mai mare de 95 %. Probele clinice de tampoane de gât cu valori T/C apropiate de valoarea critică (100) pentru pozitivitate (probe cu 512, 489 și 497 de copii pe ml ale regiunii ORF1ab, conform PCR digital) au fost utilizate pentru a verifica LOD (teste efectuate de 20 de ori în paralel). Ratele de pozitivitate ale acestor probe au fost mai mari de 95 % (tabelele suplimentare 14-16).

Pentru a evalua precizia kitului HC-FIA, s-au efectuat teste în paralel de 20 de ori pentru fiecare probă de tampon clinic de gât timp de cinci zile consecutive. Probele clinice reprezentative alese au fost o probă pozitivă (1.348 de copii pe ml ale regiunii ORF1ab), o probă de la o persoană în stare critică (critică; 512 copii pe ml) și o probă negativă (0 copii pe ml). Valorile medii T/C ale celor trei loturi în detectarea probei pozitive au fost următoarele: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) și, respectiv, 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), în comparație cu 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) și 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) pentru proba critică, și cu 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) și 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66%) pentru eșantionul negativ. Valorile CV de la lot la lot au fost de 3,89%, 4,66% și 6,74%. Astfel, testul a prezentat o precizie și o reproductibilitate bune pentru detectarea SARS-CoV-2.

Robustețea testului HC-FIA

Pentru a afla despre robustețea testului HC-FIA, am evaluat efectele substanțelor de interferență endogene (cum ar fi hemoglobina și mucina) și ale substanțelor de interferență exogene (în special, medicamente clinice utilizate în mod obișnuit în tratamentul pacienților cu infecții respiratorii, inclusiv medicamente antivirale, antibiotice și hormoni). Pentru acest experiment, am utilizat 18 probe clinice de tampoane de gât, inclusiv șase probe critice (500-530 de copii pe ml pentru regiunea ORF1ab, conform PCR digital), șase probe negative și șase probe pozitive. Rezultatele au fost, de asemenea, înregistrate ca raport al valorilor T/C (probe de interferență față de probele de control). În probele de interferență preparate, concentrațiile de hemoglobină au fost de 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 și 2,0 g l-1, iar concentrațiile pentru mucină au fost de 5 g l-1, 10 g l-1 și 20 g l-1. Concentrațiile de medicament din probele de interferență exogenă (tabelele suplimentare 17-19) au fost mult mai mari decât concentrațiile plasmatice maxime ale acestora in vivo. După cum era de așteptat, toate rapoartele T/C s-au situat în intervalul 0,9-1,1 (Setul de date suplimentar 2), ceea ce indică faptul că testul HC-FIA este robust la interferențe.

Evaluarea clinică a kitului de testare HC-FIA

Pentru a evalua în continuare performanța testului HC-FIA, a fost efectuat un studiu clinic randomizat dublu-orb prin compararea testului cu RT-qPCR (kit de detectare a SARS-CoV-2 produs de Shanghai ZJ Bio-Tech și aprobat de NMPA) sau cu rezultatele diagnosticului clinic în trei instituții medicale independente. Kitul de testare HC-FIA utilizat în cadrul evaluării clinice conținea carduri de testare, tampon de liză, soluție de conservare a probelor, controale pozitive și negative și un tub de reacție cu sonde ADN și anticorpi marcați. Rezultatele diagnosticului clinic al cazurilor confirmate sau excluse de COVID-19, care au fost furnizate de spitalele desemnate, s-au bazat pe imaginile tomografice computerizate și pe manifestările clinice ale pacienților, așa cum este specificat în liniile directoare ale „Protocolului de diagnostic și tratament pentru noua pneumonie cu coronavirus (versiunea de probă 6.0)” din China. Un total de 734 de probe (593 de tampoane de gât și 141 de spută) furnizate de 670 de persoane au fost testate în paralel. Datele brute din studiile clinice sunt furnizate ca set de date suplimentare 3. Kitul de detecție RT-qPCR pe care l-am utilizat a fost conceput ca un sistem cu trei ținte (ORF, N și E) și am urmat principiul test-retest pentru a discrimina între probele pozitive și cele negative. Pe lângă cele patru teste de eșec cauzate de un standard intern invalid, au fost efectuate opt reteste: unul pentru că doar o singură genă rdrp țintă a fost pozitivă și șapte pentru că doar genele N și E au fost pozitive. În aceste cazuri, rezultatele negative anterioare au fost excluse.

Din cei 670 de pacienți înrolați în studiu, 313 au fost bărbați (46,72%) și 357 au fost femei (53,28%). După cum se arată în figura suplimentară 3, distribuția pe vârste a populației înrolate este similară cu distribuția pe vârste a infecției cu SARS-CoV-221. Rata de vizită și rata de diagnosticare au fost, de asemenea, echilibrate. Rezultatele obținute cu ajutorul kiturilor de testare HC-FIA sunt prezentate în Fig. 3, care prezintă fotografii ale rezultatelor tipice sub o sursă de lumină fluorescentă și matricea de culoare gradient corespunzătoare după normalizarea citirii. Matricea de culori în gradient din Fig. 4 suplimentară prezintă citirile de fluorescență normalizate ale celor 734 de probe clinice (Set de date suplimentar 3).

Fotografii ale unor rezultate tipice sub o sursă de lumină fluorescentă și citirile de fluorescență corespunzătoare sub forma unei matrice cu gradient de culoare, normalizate la valoarea maximă de citire. Grupul E este format numai din rezultate COVID-19 negative. Linia orizontală de pe bara de culori indică valoarea limită. O matrice de gradient de culoare pentru citirile de fluorescență din 734 de probe clinice este furnizată în figura suplimentară 4, iar datele numerice corespunzătoare în setul de date suplimentare 3.

Pentru 621 de cazuri, rezultatele HC-FIA și diagnosticele clinice au fost în concordanță (210 cazuri confirmate și 411 cazuri excluse; tabelul 1); 49 de cazuri (27 confirmate și 22 excluse prin diagnostic clinic) au fost în neconcordanță cu rezultatele HC-FIA. Pentru 730 de probe, rezultatele testului HC-FIA au fost în concordanță cu RT-qPCR (249 pozitive și 481 negative; tabelul 1). Patru probe care au fost negative pe baza RT-qPCR au fost pozitive cu ajutorul HC-FIA. Trei dintre aceste eșantioane proveneau de la pacienți care au fost diagnosticați clinic ca fiind excluși din COVID-19, ceea ce indică faptul că testul HC-FIA a dat rezultate fals-pozitive. Proba rămasă a corespuns unui caz confirmat prin diagnostic clinic, în concordanță cu testul HC-FIA.

Cappa lui Cohen (κ), care este un indicator frecvent utilizat pentru măsurarea fiabilității acordului dintre variabilele categorice, este o măsură mai robustă în comparație cu acordul procentual simplu dintre variabile, deoarece κ ia în considerare acordurile care apar din întâmplare, în special în seturile de date dezechilibrate. Am considerat că o valoare κ mai mare de 0,75 indică un nivel ridicat de acord (un acord perfect corespunde unui κ = 1). După cum se arată în tabelul 2, rezultatele testului HC-FIA au fost în acord ridicat cu diagnosticul clinic (κ = 0,8393) și cu RT-qPCR (κ > 0,98, indiferent de tipul de eșantion).

.