Materiale

Duloxetina (DLX) de calitate pură a fost oferită cu amabilitate ca mostre cadou de către Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, India. Gradele de hidroxipropil metilceluloză (HPMC) 100 M, 4CM și 15 M CR au fost furnizate cu generozitate de Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, India. Toate celelalte substanțe chimice de laborator și reactivii utilizați în studiu au fost de calitate reactiv analitică. Pe tot parcursul studiului s-a utilizat apă bidistilată. Polietilenglicolul 400 a fost achiziționat de la S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, India. Hidrogenofosfatul de disodiu, dihidrogenofosfatul de potasiu și hidroxidul de sodiu au fost achiziționate de la CDH Ltd., New Delhi, India. Etanolul, absolut, a fost obținut de la Changshu Yangyuan Chemical, China. n-Octanolul a fost achiziționat de la E-Merck (India) Ltd., Mumbai, India. Membrana de dializă150 a fost achiziționată de la Hi Media Laboratories Ltd., Mumbai. Toate materialele și pulberile au fost depozitate în vid, la temperatura camerei.

Echipamente

Spectrele UV au fost înregistrate pe spectrofotometrul Perkin Elmer lambda 15 UV/vizibil în intervalul UV/vizibil de la 190 la 600 nm. Ansamblul celulei de difuzie Franz a fost procurat de la Permegear, Inc., SUA. Spectrofotometrul în infraroșu FT-IR-8300 a fost obținut de la spectrofotometrul Perkin Elmer PE RX 1 FTIR. Spectrele de calorimetrie cu scanare diferențială (DSC) au fost obținute cu ajutorul modelului DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Centrifuga de cercetare a fost de la REMI Equipments, Mumbai, India. pH-metrul CyberScan pH 510 a fost achiziționat de la Eutech Instruments, India.

Studii de preformulare

Prepararea soluției saline tamponate cu fosfat pH 7.4

0,19 g de dihidrogenofosfat de potasiu, 2,38 g de hidrogenortofosfat disodic și 8,0 g de NaCl au fost dizolvate în apă distilată, iar volumul a fost completat până la 1000 ml cu apă distilată. pH-ul tamponului a fost ajustat la 7,4.

Cantificarea clorhidratului de duloxetină

Conținutul de duloxetină a fost analizat prin analiză spectrofotometrică UV în soluție salină tamponată cu fosfat pH 7,4. Scanarea soluției stoc a fost efectuată în intervalul UV de la 190 la 400 nm. λ max a fost obținut la lungimea de undă de 289 nm. Soluția stoc A (250 μ/ml) de clorhidrat de duloxetină a fost preparată prin dizolvarea a 0,0250 g de medicament în soluție salină tamponată cu fosfat (pH 7,4) la 100 ml. În continuare, s-au preparat diluții în serie de la 1 μg/ml la 100 μg/ml de duloxetină prin diluarea soluțiilor stoc A și B cu soluție tampon de fosfat (pH 7,4). Valorile de absorbție ale diluțiilor au fost notate la λ max al DLX, și anume 289 nm față de soluția salină tamponată cu fosfat (pH 7,4) luată ca martor, iar curba de calibrare a fost trasată.

Caracterizarea fizico-chimică a clorhidratului de duloxetină

Determinarea punctului de topire

Cantitate mică de clorhidrat de duloxetină a fost luată în tub capilar (fuzionat la un capăt) și plasată în aparatul de punct de topire, iar temperatura de topire a fost înregistrată. În acest scop au fost efectuate trei măsurători separate și s-a obținut valoarea medie a acestora.

Determinarea coeficientului de partiție

Corectul de partiție al clorhidratului de duloxetină a fost determinat în sistemul octanol-apă (Wells 2002). Cele două faze au fost luate într-un raport v/v de 1:1 și saturate reciproc într-un agitator cu baie de apă la 37 °C, iar cele două faze au fost apoi separate. Zece miligrame de medicament au fost adăugate la un amestec de 20 ml de fază organică pre-saturată și 20 ml de apă pre-saturată și au fost agitate timp de 10 min. Baloanele au fost apoi menținute la 37 °C timp de 24 de ore, cu agitare intermitentă. Amestecul a fost ulterior centrifugat pentru a separa fazele apoase și neapoase. Cele două faze au fost analizate separat pentru duloxetină prin spectrofotometrie. Coeficientul de partiție al medicamentului „K o/w” a fost apoi calculat din raportul dintre concentrația medicamentului în octanol și faza apoasă.

Studii de interacțiune medicament-polimer

Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier

Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR) a fost utilizată pentru a analiza medicamentul pur DLX, amestecul fizic de DLX și HPMC (15 CR, 100 M și 4 M), precum și plasturii transdermici încărcați cu medicament, utilizând metoda peletelor de KBr. Toate probele au fost scanate de la 400 la 4000 cm-1.

Calorimetrie diferențială de scanare

Posibilele interacțiuni dintre medicament și polimerul utilizat au fost analizate din termogramele DSC ale clorhidratului de duloxetină medicament pur și ale formulării (HPMC + medicament) obținute cu ajutorul modelului DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Toate probele au fost sigilate în vase de aluminiu cu fund plat și au fost încălzite într-un interval de temperatură cuprins între 25 și 300 °C la o rată de creștere de 5 °C/min.

Fabricarea plasturilor transdermici

Filmele transdermice care conțin clorhidrat de duloxetină au fost turnate pe lamele de sticlă prin metoda evaporării cu solvent folosind diferite grade (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) de HPMC în prezența și absența unui plastifiant. PEG 400 (5%) a fost utilizat ca plastifiant în toate cazurile. Tabelul 1 prezintă formulele și compoziția pentru diferitele tipuri de plasturi formulați. Clorhidratul de duloxetină (60 mg) a fost dizolvat în amestec de solvenți apă-metanol (7:3). Matricea medicamentului a fost preparată prin dizolvarea unor concentrații diferite (1% și 1,5% p/v) de HPMC în același sistem de solvenți. Soluția a fost menținută netulburată timp de 24 h. Apoi, cu ajutorul unei seringi și al unui ac, soluția a fost turnată într-un inel de sticlă cu diametrul de 5,0 cm plasat pe suprafața de sticlă. Solventul a fost lăsat să se evapore timp de 6 h într-un cuptor cu control termostatic la 60 °C. Plasturii au fost depozitați într-un recipient etanș în condiții ambientale timp de 7 zile înainte de utilizare.

Tabelul 1 Formulele și compoziția sistemelor transdermice formulate de duloxetină HCl

Evaluarea plasturilor transdermici

Aspect fizic

Toate plasturii preparați au fost inspectați vizual pentru culoare, claritate, flexibilitate și netezime.

Grosimea plasturii

Grosimea plasturilor încărcate cu medicament a fost măsurată cu ajutorul unui micrometru cu filet în trei puncte diferite de pe plasturi. Valorile medii și valorile deviației standard ale celor trei citiri au fost calculate pentru fiecare plasture încărcat cu medicament.

Uniformitatea greutății

Pansamentele au fost supuse testului de variație a greutății prin cântărirea tuturor plasturelor pe un cântar digital. Determinările au fost efectuate în triplu exemplar pentru fiecare formulă. S-au calculat apoi greutatea medie și valorile deviației standard.

Studiul de planeitate

Studiul de planeitate a fost efectuat pentru a aprecia dacă plasturii transdermici preparați posedă o suprafață netedă și nu se contractă în timp. Trei benzi longitudinale au fost tăiate din folie în trei porțiuni diferite. S-a măsurat lungimea fiecărei benzi și s-a măsurat variația de lungime din cauza neuniformității planeității prin determinarea procentului de constricție, 0% constricție fiind echivalent cu 100% planeitate. Procentul de constricție a fost obținut ca (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Aici, l 1 este lungimea inițială a fiecărei benzi, iar l 2 este lungimea finală a fiecărei benzi.

Rezistența la pliere

Acest test a fost efectuat pentru a verifica eficiența plastifiantului și rezistența plasturelui preparat folosind diferiți polimeri. Rezistența la pliere este definită ca fiind numărul de pliuri necesare pentru a rupe orice plasture polimeric. Rezistența la pliere a fost măsurată manual prin plierea repetată a unei mici fâșii de folie (2 × 2 cm) în același loc până la ruperea acesteia. Numărul de ori în care plasturele a putut fi pliat în același loc fără a se rupe/fractură a dat valoarea rezistenței la pliere. Pentru test s-au luat trei plasturi de fiecare tip.

Procentul de absorbție a umidității/absorbție a vaporilor de apă

Testul de absorbție a umidității în procente a fost efectuat pentru a verifica stabilitatea fizică și integritatea foliilor în condiții de umiditate ridicată. Filmele pregătite (3,14 cm2) au fost cântărite individual cu precizie și expuse la o umiditate relativă de 85 ± 5% într-un desicator care conținea 100 ml de soluție saturată de clorură de potasiu la temperatura camerei. În această perioadă, filmele au fost cântărite la intervale regulate de timp de 24, 48 și 72 h. Absorbția procentuală de umiditate a fost determinată după următoarea formulă:

Contenutul procentual de umiditate

Acest test a fost efectuat și pentru a verifica integritatea filmelor în condiții uscate. Filmele transdermice individuale (cu suprafața specificată) au fost păstrate într-un desicator care conținea clorură de calciu anhidră topită la temperatura camerei. În această perioadă, filmele au fost cântărite la intervale regulate de timp de 24, 48 și 72 h. Conținutul procentual de umiditate a fost determinat cu ajutorul următoarei formule:

Transmiterea vaporilor de apă

Rata de transmitere a vaporilor de apă (WVTR) este definită ca fiind cantitatea de umiditate transmisă prin unitatea de suprafață a filmului în unitatea de timp. Ca celule de transmisie au fost utilizate flacoane de sticlă de volum și diametru egale. Celulele au fost spălate corespunzător și uscate în cuptor. Apoi, aproximativ 1 g de clorură de calciu topită anhidră a fost introdusă în fiecare flacon, iar plasturele a fost fixat pe marginea flaconului cu ajutorul unei benzi adezive. Aceste flacoane au fost apoi cântărite și plasate în desicatoare care conțin o soluție saturată de clorură de potasiu pentru a menține o umiditate relativă de 84%. Aceste celule au fost scoase din desicatoare și cântărite după prima, a doua, a treia, a patra, a cincea, a șasea și a șaptea zi. Rata de transmisie a vaporilor de apă a fost determinată după cum urmează:

$$ W.\ V.\ T. = WL/S $$

Unde W este greutatea vaporilor de apă transmisă, L este grosimea plasturelui și S este suprafața expusă în centimetri pătrați.

Ph-ul suprafeței

Pachetele au fost ținute în contact cu 0,5 ml de apă bidistilată timp de 1 h în tuburi de sticlă și au fost lăsate să se umfle. Un electrod de sticlă combinat a fost adus în apropierea suprafeței plasturelui și s-au efectuat citiri ale pH-ului după ce s-a lăsat o perioadă de echilibrare de 1 min.

Determinarea conținutului de medicament

Pietricele cu dimensiunea de 2 × 2 au fost tăiate din fiecare tip de formulare și puse în 100 ml de soluție salină tamponată cu fosfat pH 7,4. Conținutul a fost agitat magnetic timp de 2 h. Soluția a fost apoi filtrată prin hârtie de filtru Whatman (0,45 μ) și diluată în mod corespunzător cu soluție salină tampon de fosfat pH 7,4. Soluția a fost apoi analizată pentru absorbția sa la 289 nm, utilizând plasturele placebo ca martor. Din valorile absorbanței, s-a determinat conținutul de medicament.

Liberarea medicamentului in vitro

Celula de difuzie Franz a fost utilizată pentru caracterizarea in vitro a formulărilor transdermice. Aceasta este o metodă fiabilă pentru predicția transportului de medicamente prin piele din formulele topice. Compartimentul receptor al celulei de difuzie a fost umplut cu 30,0 ml de soluție salină tamponată cu fosfat (pH 7,4), iar studiile de eliberare a medicamentului in vitro au fost efectuate cu ajutorul unei membrane sintetice de celofan. Formulările preparate au fost aplicate pe membrana din compartimentul donator și au fost răspândite uniform pe membrana de celofan. Ansamblul a fost menținut constant la 37,0 ± 2,0 °C la 50 rpm. Probele (alicote de 1,0 ml) au fost apoi prelevate la intervale de timp adecvate (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 și 24 de ore) și reumplute cu o cantitate de mediu pentru a menține volumul fazei receptoare la 30 ml. Probele au fost analizate spectrofotometric la 289 nm.

Studii de permeabilitate a medicamentelor/studii ex vivo

Studiile de permeabilitate a medicamentelor au fost efectuate folosind pielea șobolanilor Wistar masculi. Șobolanii au fost sacrificați prin dislocare spinală. Probele de piele au fost tăiate, îndepărtate și spălate cu soluție salină normală. Grăsimea aderentă și țesutul conjunctiv au fost îndepărtate cu ajutorul unor pense cu capăt bont. Pielea a fost menținută în soluție salină normală timp de 6 h. Firele de păr de pe pielea șobolanului au fost rase cu grijă pentru a evita leziunile periferice. Compartimentul receptor al celulei de difuzie Franz a fost umplut cu 30 ml de soluție salină tamponată cu fosfat (pH 7,4). Formulările preparate au fost aplicate pe pielea șobolanului în compartimentul donator. Temperatura ansamblului a fost menținută constant la 37 ± 2 °C, iar viteza de agitare a fost controlată la 50 rpm. S-au prelevat probe (alicote de 5 ml) la intervale de timp adecvate (0,5, 1, 1, 2, 3, 4, 6, 6, 8, 8, 10, 12, 14, 16, 18 și 24 h) și au fost înlocuite cu aceeași cantitate de mediu pentru a menține volumul fazei receptoare la 30 ml. Probele au fost analizate spectrofotometric la λ max de 289 nm.

Studii de iritație cutanată

Autorizația etică pentru manipularea animalelor de laborator a fost obținută de la Comitetul instituțional de etică animală (IAEC), Universitatea Panjab, Chandigarh, iar studiile au fost efectuate conform protocolului aprobat.

Șobolanii albino Wistar au fost adăpostiți în cuști, cu acces liber la hrană și apă standard de laborator. Pielea dorsală abdominală a șobolanilor a fost rasă cu grijă, evitându-se leziunile periferice, înainte de 24 h de desfășurare a studiului. Plasturele transdermic a fost aplicat pe pielea goală și acoperit cu o bandă microporoasă nesensibilizatoare. S-a aplicat o soluție apoasă de formalină de 0,8% v/v ca iritant cutanat standard. Animalelor li s-a aplicat un nou plasture în fiecare zi, până la 7 zile. Formularea a fost îndepărtată după 7 zile; scorul eritemului a fost înregistrat și a fost comparat cu cel standard. Scorul eritemului a fost citit și înregistrat prin metoda de notare Draize (Draize et al. 1944): scorul 0 pentru lipsa eritemului, scorul 1 pentru eritem foarte ușor (roz deschis), scorul 2 pentru eritem bine definit (roz închis), scorul 3 pentru eritem moderat până la sever (roșu deschis) și scorul 4 pentru eritem sever (roșu închis).

Analiza datelor

Pentru a n-a probă, V s este volumul de probă prelevat, V t este volumul total de mediu receptor, C c este concentrația corectată, C u este concentrația necorectată a celei de-a n-a probe, iar C i este concentrația necorectată. În continuare, concentrația corectată a fost utilizată pentru a calcula valorile cantității de medicament eliberat și procentul de medicament eliberat la fiecare moment al prelevării, împreună cu rata de eliberare a medicamentului.

Coreficientul de permeabilitate este viteza de trecere a medicamentului prin membrană/piele în μg/cm2/h. Coeficientul de permeabilitate a fost calculat din panta graficului procentajului de medicament transportat în funcție de timp sub forma P = panta × V d/S

Aici, V d este volumul soluției donatoare în mililitri, iar S este suprafața țesutului în centimetri pătrați.

Fluxul (valoarea J) este definit ca fiind cantitatea de material care trece printr-o barieră cu secțiune transversală unitară în unitatea de timp. Se calculează prin: