Definiția unității
O unitate de activitate a endonucleazei de restricție este definită ca fiind cantitatea de enzimă necesară pentru a produce o digestie completă a 1 µg de substrat ADN (sau fragmente) într-un volum total de reacție de 50 µl în 60 de minute, în condiții optime de testare, așa cum se menționează pentru fiecare endonuclează de restricție.
Determinarea volumului de activitate a endonucleazelor de restricție
Sesizările de activitate a endonucleazei de restricție se efectuează prin adăugarea diferitelor diluții enzimatice în tamponul de testare corespunzător care conține 1 µg de ADN substrat. După o incubare de 60 de minute la temperatura corespunzătoare, se oprește digestia și probele de ADN se vizualizează prin electroforeză pe gel de agaroză/bromură de etidiu. Soluția enzimatică cea mai diluată care dă o digestie completă este utilizată pentru a calcula activitatea în unități/µl.
Atenție: activitatea este dependentă de substrat și, atunci când se lucrează cu un substrat nou, enzima trebuie titrată pentru a determina activitatea reală sau așteptată.
Controale de calitate
Rezultatele tuturor testelor de control al calității sunt raportate pe fișa tehnică furnizată împreună cu fiecare enzimă.
Test de supradigestie
Un test de supradigestie a fost utilizat ca o determinare calitativă a purității enzimei și a lipsei de DNaze nespecifice. În testul de supradigestie, se adaugă cantități din ce în ce mai mari din fiecare endonuclează de restricție (de obicei 10, 20, 30, 40, 50 de unități) la o serie de tuburi care conțin 1 µg de ADN substrat. După o incubare de 20 de ore în condițiile de testare recomandate, se determină prin electroforeză pe gel de agaroză/bromură de etidiu numărul maxim de unități care dau un tipar de benzi clar, clar și normal.
Pentru a trece testul, enzima trebuie să dea un tipar de benzi nealterat în condiții de supradigestie de până la 600 de ori (unități x ore) în comparație cu o digestie de 2 ori. În cazul în care enzima prezintă activitate „stea” la un exces funcțional mai mic de 600 de ori, descrierea produsului include informații privind excesul funcțional la care nu apare activitatea „stea”.
Test pentru endonucleaze nespecifice
Pentru a testa contaminarea cu endonucleaze nespecifice, fiecare endonuclează de restricție este incubată cu un substrat plasmidic supraînfășurat lipsit de secvența de recunoaștere a endonucleazei de restricție. O singură crestătură nespecifică în ADN RF I îl transformă în forma RF II (cerc crestat). Cantități din ce în ce mai mari de enzimă (de obicei 10, 20, 30, 40, 50 de unități) se adaugă la o serie de tuburi care conțin 1 µg de ADN RF I (forma supraînfășurată). După o incubare de 20 de ore în condițiile de testare recomandate, cele două forme se disting pe geluri de agaroză și se determină procentul de conversie de la RF I la RF II.
Testul de ligare și de retăiere
Un test de ligare a fost utilizat pentru a determina puritatea funcțională a ADN-ului după digestia cu enzime de restricție. ADN-ul substrat este complet digerat cu un exces de 10 și 50 de ori mai mare de endonucleaza de restricție în tamponul de analiză adecvat, ligat cu ADN-ligază T4 și retezat cu aceeași enzimă de restricție. ADN-urile tăiate, ligaturate și retăiate se analizează prin electroforeză pe gel de agaroză/electroforeză cu bromură de etidiu. Un model de bandă normal indică terminațiile 5 și 3 intacte, precum și absența nucleazelor sau fosfatazelor contaminante.
Stabilitate
Toate endonucleazele de restricție Jena Bioscience sunt retestate la fiecare 4-6 luni. Acest proces ne permite să asigurăm o activitate enzimatică completă și o performanță optimă la fiecare enzimă pe care o expediem. Datorită rezultatelor excelente ale acestei testări, am extins datele de expirare ale majorității enzimelor noastre la 18 luni.

.