- Abstract
- 1. Introducere
- 2. Materiale și metode
- 2.1. Organisme și condiții de cultivare
- 2.2. Prepararea extractelor fungice
- 2.3. Activitatea genoprotectoare
- 2.3.1. Subiecți
- 2.3.2. Designul studiului
- 2.3.3. Testul de electroforeză pe gel monocelular
- 2.4. Activitate antioxidantă
- 2.4.1. DPPH- Assay
- 2.4.2. Determinarea conținutului total de fenoli
- 2.4.3. Determinarea conținutului total de flavonoide
- 2.5. Analiza statistică
- 3. Rezultate și discuții
- 3.1. Randamentul de extracție
- 3.2. Activitate genoprotectoare
- 3.3. Activitate antioxidantă
- 4. Concluzie
- Conflict de interese
- Recunoștințe
Abstract
Speciile Trametes au fost utilizate de mii de ani în medicina tradițională și convențională pentru tratamentul diferitelor tipuri de boli. Scopul a fost de a evalua posibilele efecte antigenotoxice ale extractelor de miceliu și basidiocarp ale unor specii selectate de Trametes și de a evalua dependența de potențialul lor antioxidant. Speciile studiate au fost Trametes versicolor, T. hirsuta și T. gibbosa. Potențialul antigenotoxic al extractelor a fost evaluat pe celulele albe din sângele periferic uman cu extracte de basidiocarp și miceliu ale speciilor. Testul cometei alcaline a fost utilizat pentru detectarea rupturilor de șiruri de ADN și a situsurilor alcaline-labile, precum și a gradului de migrare a ADN-ului. Testul DPPH a fost utilizat pentru a estima proprietățile antioxidative ale extractelor. Extractele din corpul fructifer al T. versicolor și T. gibbosa, precum și extractele de T. hirsuta, cu excepția celui la 20,0 mg/mL, nu au fost agenți genotoxici. Extractul de T. versicolor a avut, la 5,0 mg/mL, cel mai mare efect antigenotoxic atât în pre cât și în posttratamentul leucocitelor. Extractele de miceliu ale celor trei specii nu au avut nicio activitate genotoxică și un efect antigenotoxic semnificativ împotriva leziunilor ADN induse de H2O2, atât în pre cât și în posttratament. Rezultatele sugerează că extractele acestor trei specii ar putea fi considerate ca agenți antigenotoxici puternici, capabili să stimuleze răspunsul genoprotector al celulelor.
1. Introducere
Cupercile au fost folosite de mult timp ca aliment, dar în egală măsură și în medicina tradițională atât din lumea occidentală cât și din cea orientală . Chiar dacă numeroase ciuperci sunt recunoscute ca alimente sănătoase , marele lor potențial farmacologic este încă subutilizat . Aproape 60 de specii de Trametes sunt cunoscute ca locuind în lume, dar doar câteva dintre ele sunt analizate pentru proprietățile lor medicinale . Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd este cea mai cunoscută specie medicinală din acest gen. Această specie, ale cărei denumiri populare sunt Turkey Tail (coada curcanului) în culturile occidentale, Yun-Zhi (ciupercă cu aspect de nor) în China sau Kawaratake (ciupercă de pe malul râului) în Japonia, este utilizată de mii de ani în medicina tradițională, în special în Asia . Conform Compendiului de Materia Medica Chineză, scris în timpul dinastiei Ming, au fost înregistrate peste 120 de tulpini de T. versicolor, iar în practica medicinală tradițională chineză această ciupercă este considerată utilă pentru eliminarea toxinelor, întărire, creșterea energiei, îmbunătățirea funcției ficatului și a splinei și îmbunătățirea răspunsului imunitar, în special atunci când este uscată, măcinată și preparată în ceai . Toate aceste proprietăți au fost considerate foarte utile în medicina populară pentru utilizarea cronică a preparatelor din Trametes spp. În medicina convențională, specia este utilizată în principal pentru tratamentul diferitelor tipuri de cancere, dar și pentru hepatita cronică, artrita reumatoidă și infecțiile tractului respirator, urinar și digestiv, fapt confirmat de numeroase studii . În plus, au fost raportate efecte antivirale puternice ale unor polizaharopeptide izolate din T. versicolor și o activitate antioxidantă semnificativă a extractelor din corpul fructifer al Trametes spp. Aceste efecte se bazează în principal pe producerea polizaharidului krestin (PSK) și a diferiților complecși polizaharidici-peptidici, compuși care reduc metastazele canceroase și stimulează producția de interleukină-1 în celulele umane .
Prezența abundentă a radicalilor liberi în mediul înconjurător este asociată cu apariția stresului oxidativ care stă la baza îmbătrânirii și a declanșării și evoluției diferitelor boli și afecțiuni de care suferă și moare o mare parte din populația lumii . ADN-ul este mai sensibil la deteriorarea oxidativă decât alte macromolecule. Leziunile ADN, cum ar fi rupturile de catenă, ar putea fi induse de diverși agenți, printre care H2O2 produce un efect genotoxic. Se știe că aceste leziuni pot afecta răspunsul imunitar nu numai în cazul bolilor inflamatorii, ci și în cazul cancerelor . Testul cometei este un test bine stabilit și eficient, de mare sensibilitate, care a fost utilizat pentru examinarea leziunilor ADN și poate fi aplicat pentru a evalua potențialul genotoxic și protector al mai multor produse naturale .
O activitate genoprotectoare a extractelor de ciuperci bazată pe reducerea leziunilor oxidative ale ADN-ului poate juca, de asemenea, un rol semnificativ în prevenirea și tratamentul mai multor boli și tulburări menționate, dar foarte puține studii până în prezent au considerat-o ca un posibil instrument de acțiune în diferite terapii . Prin urmare, scopul studiului a fost de a evalua efectele antigenotoxice ale extractelor de miceliu și basidiocarp ale unor specii selectate de Trametes asupra globulelor albe periferice umane și de a evalua dependența de potențialul antioxidant al acestora.
2. Materiale și metode
2.1. Organisme și condiții de cultivare
Culturile de Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301 și T. gibbosa BEOFB 310 au fost izolate din corpuri fructifere colectate din Serbia și menținute pe mediu Malt agar în colecția de culturi a Institutului de Botanică, Facultatea de Biologie, Universitatea din Belgrad (BEOFB).
Inoculul a fost pregătit prin inocularea a 100,0 ml de mediu sintetic (glucoză, 10.0 g L-1; NH4NO3, 2,0 g L-1; K2HPO4, 1,0 g L-1; , 0,4 g L-1; , 0,5 g L-1; extract de drojdie, 2,0 g L-1; pH 6,5) cu 25 discuri miceliene (Ø 0.5 cm, din cultura de 7 zile din agar malț) în flacoane de 250 ml și incubare pe un agitator rotativ la 100 rpm, la temperatura camerei (°C) timp de 7 d. Biomasa rezultată a fost spălată și omogenizată cu 100,0 ml de apă distilată sterilă (dH2O) într-un blender de laborator. Biomasa omogenizată (30,0 ml) a fost utilizată pentru inocularea a 500,0 ml de mediu sintetic modificat (cu glucoză prezentă la 65,0 g L-1). Cultivarea submersă a fost efectuată în flacoane de 1000 mL la temperatura camerei pe un agitator rotativ timp de 21 d. Biomasa obținută a fost filtrată, spălată de 3 ori cu dH2O pe un agitator magnetic și uscată la 50°C până la greutate constantă.
2.2. Prepararea extractelor fungice
Corpul de fructificare uscat și miceliul (3,0 g) au fost extrase prin agitare cu 90,0 ml de etanol 96% la 30°C timp de 72 h. Extractele rezultate au fost centrifugate (20°C, 3000 rpm, 15 min), iar supernatantele au fost filtrate prin hârtie de filtru Whatman numărul 4, concentrate sub presiune redusă într-un evaporator rotativ (BÜCHI R-114, Elveția) la 40°C până la uscare și redisolvate în etanol 96% pentru testul antioxidant sau în apă pentru testul antigenotoxic până la o concentrație inițială de 20,0 mg mL-1. Randamentul de extracție a fost exprimat ca procent pe bază de greutate uscată.
2.3. Activitatea genoprotectoare
2.3.1. Subiecți
Eșantioane de sânge integral heparinizat au fost obținute prin puncție venoasă de la trei donatori sănătoși cu vârsta sub 25 de ani. Participanții la studiu au fost nefumători și nealcoolici, nu au primit nici o terapie sau medicamente și nu au luat suplimente alimentare.
2.3.2. Designul studiului
Genotoxicitatea tuturor extractelor și concentrațiilor (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625 și 0,312 mg mL-1) a fost studiată prin tratarea globulelor albe din sângele periferic uman la 37°C timp de 30 min cu scopul de a evalua deteriorarea ADN. În mod normal, se utilizează celule albe din sânge, deoarece acestea sunt obținute într-un mod relativ neinvaziv, nu necesită dezagregarea țesuturilor și se comportă bine în testul cometei . Tratamentul cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) la 37°C timp de 30 min a fost utilizat ca martor pozitiv, iar tratamentul cu 25,0 μM H2O2 la gheață timp de 15 min a fost utilizat ca martor negativ.
Au fost utilizate două protocoale independente pentru a evalua potențialul antigenotoxic al extractelor, folosind pretratarea și posttratarea cu extractele. În cazul pretratamentului, celulele au fost incubate cu extractele la 37°C timp de 30 min, apoi au fost spălate cu PBS și expuse la H2O2 timp de 15 min. În cazul posttratamentului, celulele au fost tratate cu H2O2 la gheață timp de 15 minute, clătite cu PBS și apoi tratate cu cele șapte concentrații de extract la 37°C timp de 30 de minute. După fiecare tratament, celulele au fost spălate cu PBS. Incubarea cu PBS la 37°C timp de 30 min a reprezentat controlul negativ, iar tratamentul cu 25,0 μM H2O2 la gheață timp de 15 min a reprezentat controlul pozitiv.
Au fost efectuate trei replici pentru fiecare experiment și 100 de nuclee au fost analizate pentru fiecare.
2.3.3. Testul de electroforeză pe gel monocelular
Testul cometa a fost efectuat așa cum a fost descris de Singh și colab. . Testul cometei alcaline este capabil să detecteze rupturile de șiruri de ADN și situsurile labile alcaline, iar gradul de migrare a ADN-ului indică gradul de deteriorare a ADN-ului în celule.
Eșantioanele de sânge integral (6,0 μL) au fost suspendate în agaroză cu punct de topire scăzut (LMP) de 0,67% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și au fost pipetate pe lame de microscop din sticlă supraînghețată, preacoperite cu un strat de agaroză cu punct de topire normal de 1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), întinse cu ajutorul unui capac și menținute la gheață timp de 5 minute pentru a se solidifica. După ce au fost îndepărtate ușor lamelele de acoperire, suspensiile de celule de pe lamele au fost tratate cu extracte și H2O2, așa cum s-a descris mai sus. În urma tratamentelor, toate lamelele au fost acoperite cu un al treilea strat de agaroză LMP 0,5% și, din nou, s-a lăsat să se solidifice la gheață timp de 5 minute. După îndepărtarea lamelelor de acoperire, lamelele au fost plasate în soluție de liză rece (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100 și 10% dimetilsulfoxid, pH 10,0 ajustat cu NaOH) la 4°C peste noapte și apoi au fost supuse electroforezei și colorării cu bromură de etidiu. Cometele au fost observate și analizate cu ajutorul unui microscop Olympus ×50 (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Germania), echipat cu un dispozitiv de înregistrare a fluorescenței la o mărire de 100x. Evaluarea deteriorării ADN-ului a fost efectuată conform descrierii lui Anderson și colab. . Și anume, celulele au fost clasificate cu ochiul liber în cinci categorii care corespund următoarelor cantități de ADN din coadă: (A) nicio deteriorare, <5%; (B) deteriorare de nivel scăzut, 5-20%; (C) deteriorare de nivel mediu, 20-40%; (D) deteriorare de nivel ridicat, 40-95%; (E) deteriorare totală, >95% (figura 1). Analiza a fost efectuată pe 100 de celule selectate aleatoriu pentru fiecare subiect (50 de celule din fiecare dintre cele 2 lame replicate). Pentru a obține o analiză semicantitativă a datelor, deteriorarea ADN a fost caracterizată ca fiind o migrare a ADN peste 5% (clasele cometa B + C + D + E).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
2.4. Activitate antioxidantă
2.4.1. DPPH- Assay
Activitatea antioxidantă a fost definită prin măsurarea decolorării soluției de metanol de culoare purpurie a radicalului stabil 1,1-difenil-2-picrilhidrazil () . Efectele de scavenging au fost măsurate spectrofotometric (CECIL CE 2501) la 517 nm și calculate cu ajutorul ecuației:unde este absorbanța controlului negativ (amestec de reacție fără extract) și este absorbanța amestecului de reacție.
Concentrația extractului (mg extract/mL) care asigură 50% din reducere (EC50) a fost obținută prin interpolare din analiza de regresie liniară. Toate măsurătorile au fost efectuate în triplu exemplar pentru analiza statistică. Antioxidantul comercial, butilhidroxianisol (BHA), într-un interval de concentrație de 20,0 mg mL-1-0,02 mg mL-1, a fost utilizat ca martor pozitiv.
2.4.2. Determinarea conținutului total de fenoli
Compușii fenolici totali din extractele de miceliu au fost estimați cu reactivul Folin-Ciocalteu conform metodei lui Singleton și Rossi , folosind acidul galic ca standard. Concentrația a fost determinată ca μg de echivalenți de acid galic (GAE) pe mg de extract uscat, folosind o ecuație care a fost obținută dintr-un grafic standard de acid galic ca
2.4.3. Determinarea conținutului total de flavonoide
Contenutul total de flavonoide a fost determinat prin metodele lui Park et al. folosind quercetina ca etalon. Cantitatea a fost exprimată ca μg de echivalenți de quercetină (QE) pe mg de extract uscat, folosind o ecuație obținută dintr-un grafic standard de quercetină hidratată ca
2.5. Analiza statistică
Rezultatele au fost exprimate ca medie ± eroarea standard a datelor obținute din trei măsurători paralele. S-a efectuat o analiză a varianței (ANOVA) într-o singură direcție cu ajutorul software-ului STATISTIKA, versiunea 5.0 (StatSoft Inc.) pentru a testa orice diferențe semnificative. valorile mai mici de 0,01 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic. Analiza statistică a datelor din testul cometa a fost realizată prin testul χ2 utilizând software-ul Statgraph 4.2. Pentru a efectua testul χ2, rezultatele din cele trei experimente au fost reunite și am evaluat numărul total de celule cu leziuni ale ADN-ului. O diferență la a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.
3. Rezultate și discuții
3.1. Randamentul de extracție
Randamentul de extracție a biomasei de miceliu pentru toate cele trei specii a fost semnificativ mai mare în comparație cu corpul fructifer (). T. gibbosa a avut cel mai mare randament de extracție din biomasa de miceliu uscată (34,6%) și cel mai mic randament din corpurile fructifere uscate (2,2%). Cel mai mare randament de extracție a corpului fructifer, de 6,67%, a fost constatat la T. versicolor, al cărui randament de extracție a miceliului a fost de 8,0%. Randamentele la T. hirsuta au fost de 12,0% (pentru miceliu) și 2,85% (pentru corpul fructifer). Diferențele în randamentul de extracție între specii, atât pentru miceliu cât și pentru corpul fructifer, au fost semnificative din punct de vedere statistic ().
Raporturile anterioare au arătat dependența extractibilității biomasei de specie, tulpină și solvent . Astfel, Ren et al. au constatat că randamentele de extracție ale bazidiocarpului de T. gibbosa au fost de 1,22% pentru extractul de eter de petrol, 6,44% pentru extractul de acetat de etil și 9,2% pentru cel de metanol. Metanolul a fost, de asemenea, un bun solvent pentru basidiocarpul de T. versicolor, al cărui randament a variat între 4,1% și 9,16% . Pe baza rezultatelor noastre, se poate concluziona că alcoolii sunt cei mai buni solvenți, dar etanolul este mai slab decât metanolul.
3.2. Activitate genoprotectoare
Pentru că toți donatorii de sânge aveau o stare de sănătate bună și o vârstă similară și nu erau sub tratament medicamentos, analiza statistică nu a arătat diferențe clare în răspunsurile lor la extracte. Prin urmare, rezultatele din cele trei experimente au fost puse în comun. Tratarea leucocitelor din sângele periferic cu H2O2 a provocat o inducere rapidă și puternică a rupturilor monocatenare în ADN-ul nuclear, care a fost vizibilă în testul cometei ca migrație a ADN-ului.
Rezultatele noastre au demonstrat că extractele de corpuri fructifere de T. versicolor de la 0,312 la 20.0 mg mL-1 nu a provocat o creștere semnificativă a numărului total de celule cu ADN deteriorat în comparație cu martorul pozitiv, ceea ce arată în mod clar că extractul testat nu a fost un agent genotoxic [Figura 2(a) (A)]. Distribuția (valoarea) daunelor totale ale ADN-ului a fost, de asemenea, aceeași ca în cazul controlului pozitiv. Pe de altă parte, aceste extracte au arătat efecte protectoare împotriva H2O2 atât în pre- cât și în post-tratarea leucocitelor [Figura 2(a) (B, C)]. Extractul la 5,0 mg mL-1 a avut cel mai mare efect, iar la 20,0 mg mL-1 cel mai mic efect în ambele tratamente. Valoarea deteriorării totale a ADN-ului a scăzut statistic în comparație cu controlul pozitiv în toate concentrațiile ().
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Extractul de corpuri fructifere de T. hirsuta la toate concentrațiile, cu excepția a 20,0 mg mL-1, nu a prezentat activitate genotoxică, deoarece nivelul total de leziuni ale ADN-ului nu a fost mai mare din punct de vedere statistic decât cel din martorul pozitiv [Figura 2(b) (A)]. Cu toate acestea, la o concentrație de 20,0 mg mL-1, efectul genotoxic și deteriorarea totală a ADN-ului în celule au fost diferite din punct de vedere statistic în comparație cu martorul pozitiv. În pre și posttratarea leucocitelor, extractul la toate concentrațiile, cu excepția celei mai mari, a prezentat un efect protector împotriva deteriorării ADN-ului induse de H2O2, prezentând o scădere semnificativă a deteriorării totale a ADN-ului în comparație cu martorul pozitiv [Figura 2(b) (B, C)]. Aceste tratamente au prezentat o corelație dependentă de doză, cu cel mai mare efect protector la o concentrație a extractului de 0,312 mg mL-1, în timp ce concentrația de 20 mg mL-1 nu a arătat nicio protecție împotriva cometelor induse de H2O2.
Absența unui efect genotoxic, precum și a unui efect antigenotoxic semnificativ, adică reducerea leziunilor ADN induse de H2O2, atât în pre cât și în posttratament, a fost, de asemenea, observată pentru extractul de corpuri fructifere de T. gibbosa la cele șapte concentrații [Figura 2(c)]. Cu toate acestea, spre deosebire de extractele de T. hirsuta, nu s-a observat un răspuns dependent de doză în cazul extractelor de basidiocarp de T. gibbosa; și anume, o scădere treptată a concentrației extractului nu a corespuns cu o reducere proporțională a genotoxicității induse de H2O2.
Extractele de miceliu de T. versicolor, T. hirsuta și T. gibbosa, la toate concentrațiile analizate, nu au avut activitate genotoxică (figurile 3(a) (A), 3(b) (A) și 3(c) (A)). Toate extractele și concentrațiile de miceliu au prezentat un efect antigenotoxic semnificativ împotriva deteriorării ADN-ului induse de H2O2, atât în pretratament, cât și în post-tratament, iar aceste activități nu au fost semnificativ diferite. În cazul T. versicolor, s-a observat o activitate ușor mai scăzută la cea mai mică concentrație de extract. La T. hirsuta, concentrațiile de 5,0, 2,5 și 20,0 mg mL-1 au fost mai eficiente, în timp ce la T. gibbosa, cel mai mare efect protector a fost observat la o concentrație de 2,5 mg mL-1 și cel mai mic la 20,0 mg mL-1 [figurile 3(a) (B, C), 3(b) (B, C) și 3(c) (B, C)].
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Numeroși compuși mutageni și cancerigeni sunt prezenți în diferite surse naturale . Pe de altă parte, unii compuși naturali ar putea fi fie prooxidanți care provoacă efecte genotoxice și/sau citotoxice, fie antioxidanți, în funcție de concentrația și durata de expunere . Speciile de ciuperci foarte valoroase din punct de vedere nutrițional și medicinal pot avea efecte diferite in vitro și in vivo, fie din cauza instabilității lor în condiții de digestie, fie din cauza incapacității de absorbție de către tractul gastrointestinal . Astfel, activitățile obținute in vitro nu corespund în mod necesar cu cele constatate in vivo . De asemenea, este important de subliniat faptul că efectele genotoxice și antigenotoxice ale extractelor de ciuperci depind de specie, de concentrație și de testul utilizat pentru evaluarea acestora . Astfel, rezultatele noastre au demonstrat capacități diferite ale celor trei specii de Trametes în ceea ce privește diminuarea leziunilor ADN induse de H2O2; de exemplu, cea mai mică activitate a fost observată în extractul de corp fructifer de T. hirsuta. O relație clară de răspuns invers la doză între nivelul de deteriorare a ADN-ului și concentrația extractului a fost observată doar în extractul de basidiocarp din T. hirsuta. Cu toate acestea, la T. versicolor și T. gibbosa, creșterea concentrației extractului peste doza optimă nu a dus la nicio îmbunătățire a rezultatelor cometei, ceea ce confirmă rezultatele lui Miyaji et al. Acești autori au arătat absența unei relații doză-răspuns între concentrațiile de extract de Lentinus edodes și efectul antigenotoxic al acestora. Este important de menționat că ingredientele fenolice, flavonoide și alte ingrediente combinate din extracte ar trebui să aibă un potențial mai mare decât componentele individuale ale extractelor, ceea ce indică semnificația coacțiunilor dintre toate ingredientele . Această constatare ar putea avea ca rezultat o tendință diferită a activității antigenotoxice a Trametes spp. Dependența activității genotoxice a extractului de tipul de test a fost demonstrată de Morales et al.; astfel, aceștia au raportat absența efectului mutagenetic al extractelor de basidiocarp de Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus și Pleurotus ostreatus asupra celulelor de mamifere folosind testul Ames Salmonella/microsom. Cu toate acestea, s-a obținut o activitate slabă a extractului de P. ostreatus folosind testul CHO/HPRT.
Mecanismele care stau la baza efectului antigenotoxic al extractelor de ciuperci nu sunt încă complet cunoscute. Efectele protectoare ale extractelor par să se bazeze pe mai mult de un mecanism de acțiune, ceea ce nu este neobișnuit în cazul ciupercilor, conform lui Gebhart . Mecanismele de antigenotoxicitate ar putea fi evaluate prin aplicații de pre- și post-tratamente, adică diverse combinații de extracte și H2O2. Rezultatele noastre pozitive în ambele tratamente indică faptul că extractele au efecte protectoare atât la nivel de prevenire, cât și la nivel de intervenție și pot acționa ca desmutageni și bioantimutageni, lucru demonstrat și de studii anterioare . Eficiența pretratamentului, observată în studiul de față, ar putea fi explicată prin creșterea capacității antioxidante a celulelor, adică prin stimularea sintezei și activității enzimelor antioxidante în timpul inducerii stresului oxidativ . Efectul pozitiv al post-tratamentului ar putea fi rezultatul acțiunii sinergice a activităților de intervenție prin intermediul captării radicalilor liberi și al stimulării enzimelor antioxidante, precum și al excitării reparării ADN-ului, așa cum au sugerat Chiaramonte et al. . Deoarece acești autori au raportat o reparare semnificativă a leziunilor ADN după 30-60 de minute de expunere la un agent oxidativ, s-ar putea concluziona că repararea ADN a jucat un rol mai puțin semnificativ în protecția împotriva H2O2, deoarece condițiile de post-tratament au luat în considerare până la 30 de minute de incubare. Prin urmare, activitatea genoprotectoare a extractelor de Trametes spp. se bazează probabil pe acțiuni antioxidante. Pe de altă parte, se știe că organismele eucariote au evoluat o cale de semnalizare, numită răspuns la deteriorarea ADN, pentru a se proteja împotriva insultelor genomice. Gasser și Raulet au demonstrat că răspunsul la deteriorarea ADN alertează sistemul imunitar prin inducerea expresiei liganzilor de la suprafața celulară pentru receptorul imunitar activator NKG2D, care este exprimat de celulele ucigașe naturale (celule NK) și de unele celule T. Prin urmare, activitatea genoprotectoare a Trametes spp. în celulele expuse la agenți genotoxici ar putea modula răspunsul la leziuni ale ADN-ului și funcționa ca o barieră în tumorigeneza timpurie. Cercetările ulterioare ar trebui să includă analiza nivelurilor de superoxid dismutază și catalază în limfocitele tratate cu extracte de Trametes spp. atât în pre- cât și în post-tratamentul cu H2O2, pentru a confirma ipoteza că sporirea capacității antioxidante în celule este indusă de aceste extracte.
3.3. Activitate antioxidantă
Extractele etanolice testate au fost buni antioxidanți, dar activitatea lor a depins de specie. Extractele din corpul fructifer au prezentat efecte de curățare semnificativ mai mari decât extractele de miceliu (). Cea mai mare activitate de captare a radicalilor DPPH a fost detectată în extractele de T. versicolor, atât în corpul fructifer cât și în miceliu (63,5% și 59,4%, respectiv), care a fost confirmată de valorile EC50 (15,22 mg mL-1 și 16,18 mg mL-1, respectiv). Un nivel ușor mai scăzut de activitate a fost constatat pentru extractele de T. hirsuta (59,0% pentru basidiocarpi și 46,8% pentru miceliu), ale căror concentrații de 17,06 mg mL-1 și, respectiv, 21,81 mg mL-1 au asigurat o reducere de 50% a radicalilor. T. gibbosa a fost specia cu cel mai mic potențial de curățare, în special a extractelor de miceliu (39,7%), cu o valoare EC50 de 26,15 mg mL-1. Cu toate acestea, capacitatea de captare a radicalilor a extractului din corpul fructifer nu a fost semnificativ mai mică în comparație cu celelalte două specii (53,7% și EC50 de 18,13 mg mL-1). Activitatea de captare a antioxidantului sintetic BHA a fost de 94,28%, iar o concentrație de 0,10 mg mL-1 a asigurat o reducere de 50%.
Conținuturile totale de fenoli din extractele de corp fructifer și miceliu ale speciilor de Trametes au fost semnificativ diferite () (tabelul 1). În general, conținutul de fenoli din extractele din corpul fructifer a fost mai mare decât în extractele de miceliu.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Atât extractele din bazidiocarpul T. versicolor, cât și cele din miceliul T. versicolor au fost cele mai bogate în fenoli și flavonoide, în timp ce cele mai mici concentrații au fost măsurate în extractele din T. gibbosa. În funcție de concentrațiile de fenoli și flavonoide, extractele de T. hirsuta s-au situat între extractele celorlalte două specii (tabelul 1). Gradul de corelație între activitatea de curățare a extractelor și conținutul de fenol și flavonoide a fost ridicat, cu 0,98 și, respectiv, 0,99 pentru corpurile fructifere și, respectiv, 0,97 și, respectiv, 0,99 pentru miceliu.
Studii anterioare au indicat, de asemenea, potențialul antioxidant al speciilor de Trametes . Astfel, Kamiyama și colab. au demonstrat că o concentrație de extract chiar și de 0,5 mg mL-1 a absorbit aproape 50% din în funcție de solvent, în timp ce Johnsy și Kaviyarasana au observat reducerea chiar și a 91,5% a radicalilor de către un extract de metanol de basidiocarpi de T. gibbosa la o concentrație de 1,0 mg mL-1. Extractele de etanol testate în studiul nostru au avut capacități ușor mai mici, dar mai mari decât extractele de corpuri fructifere de T. hirsuta din etanol analizate de Sheikh et al.
Potrivit lui Mau et al. și Palacios et al. , compușii fenolici joacă un rol cheie în activitatea antioxidantă. Acești compuși sunt constituenți foarte abundenți și importanți ai corpurilor fructifere și miceliilor de ciuperci. Capacitatea lor se bazează pe prezența grupărilor hidroxil care acționează ca agenți reducători, chelatori de metale, stingători de oxigen singuret și donatori de hidrogen . Cu toate acestea, în unele cazuri, activitatea lor nu a putut fi atribuită conținutului total de fenoli din extracte, ceea ce este confirmat prin compararea rezultatelor noastre cu cele ale lui Johnsy și Kaviyarasana . Mai exact, 91,5% din a fost redus de extractul de basidiocarp de T. gibbosa care conținea 23,8 μg GAE mg-1 extract, în timp ce un extract din tulpina BEOFB 310 cu o concentrație de fenol de 20,07 μg GAE mg-1 extract a eliminat doar 63,5% din radicali. Cu toate acestea, concentrația de flavonoide în tulpina T. gibbosa sârbă a fost semnificativ mai mare în comparație cu tulpina testată de Johnsy și Kaviyarasana (7,63 μg QE mg-1 de extract și 0,59 μg QE mg-1 de extract, respectiv), iar acest lucru ar putea fi explicat prin diferitele polarități ale solvenților, precum și prin capacitatea diferită a tulpinii de sinteză a flavonoidelor .
4. Concluzie
Studiul a fost prima încercare de a evalua activitatea protectoare a ADN-ului din extractele de T. versicolor, T. hirsuta și T. gibbosa și determină dacă aceasta s-a bazat pe potențialul lor antioxidant. Rezultatele sugerează că extractele acestor trei specii ar putea fi considerate agenți antigenotoxici puternici, capabili să stimuleze răspunsul genoprotector al celulelor, contribuind la îmbunătățirea funcției imunitare, la eliminarea toxinelor și la întărire, ceea ce se referă la utilizarea tradițională. Cu toate acestea, sunt necesare investigații suplimentare pentru a dezvălui purtătorii specifici ai activității antigenotoxice și modul de protecție a ADN-ului împotriva daunelor oxidative.
Conflict de interese
Autorii declară că nu au niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Recunoștințe
Autorii mulțumesc profesorului Dr. Steve Quarrie, profesor invitat la Universitatea din Newcastle, Marea Britanie, pentru revizuirea și îmbunătățirea limbii engleze. Acest studiu a fost realizat cu sprijinul financiar al Ministerului Educației, Științei și Dezvoltării Tehnologice din Republica Serbia, Proiectul nr. 173032 și Proiectul nr. 173034.
.
Lasă un răspuns