Doxycycline Is Anti-Inflammatory and Inhibits Staphylococcal Exotoxin-Induced Cytokines and Chemokines

Toxina 1 a sindromului de șoc toxic stafilocococic (TSST-1) și exotoxinele înrudite structural sunt exotoxine bacteriene care se leagă direct de moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa II de pe celulele prezentatoare de antigen (1, 5, 8, 18, 23) și activează celulele T care exprimă elemente Vβ specifice (7). Aceste toxine sunt numite superantigeni datorită capacității lor de a stimula policlonal populații mari de celule T (1, 4, 7, 14). Astfel, exotoxinele stafilococice (SE) sunt activatori puternici ai sistemului imunitar și cauzează o varietate de boli la om, inclusiv intoxicații alimentare, șocuri toxice și boli autoimune (1, 2, 6, 12, 14, 22). Interacțiunile acestora cu celulele sistemului imunitar duc la producerea masivă de citokine și chemokine proinflamatorii (1, 4, 15, 17). Citokinele factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α), interleukina-1 (IL-1) și interferonul gamma (IFN-γ) sunt mediatori-cheie în șocul toxic indus de superantigeni (1, 21). Atât TNF-α, cât și IL-1 au activități imunostimulatoare puternice și acționează sinergic cu IFN-γ pentru a intensifica reacțiile imune și a favoriza leziunile tisulare (16). În consecință, aceste citokine sunt patogene la concentrații ridicate in vivo și sunt responsabile de febra și șocul toxic induse de SE (13, 14, 18, 19).

Doxiciclina este un antibiotic cu spectru larg utilizat pe scară largă pentru infecțiile cauzate atât de microorganisme gram-negative, cât și de cele gram-pozitive. Ea acționează ca un agent bacteriostatic și este foarte eficientă împotriva multor microorganisme, inclusiv Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis și Yersinia pestis. Doxiciclina face parte din familia antibioticelor tetracicline, ai căror membri s-au dovedit a avea și alte acțiuni biologice independente de efectele lor antimicrobiene (10). Doxiciclina inhibă metaloproteinaza 8 (MMP-8) și MMP-9 din matrice mediată de forbol-12-miristat-13-acetat în celulele endoteliale umane (11). Doxiciclina scade, de asemenea, degradarea elastinei și reduce activitatea MMP într-un model de boală anevrismală (3). Mai recent, s-a demonstrat că doxiciclina inhibă producția de IL-1β în culturile epiteliale corneene tratate cu lipopolizaharide într-o măsură comparabilă cu cea obținută prin corticosteroizi (25). In vivo, doxiciclina a protejat șoarecii de endotoxemia letală prin reducerea secreției de citokine și de nitrați în sânge (20). Acest studiu a fost întreprins pentru a determina efectul modulator al doxiciclinei asupra activării celulelor T induse de superantigenul stafilococic și a producției de citokine din celulele mononucleare din sângele periferic uman (PBMC).

PCBMC umane au fost izolate prin centrifugarea în gradient de densitate Ficoll-Hypaque din sânge heparinizat de la donatori umani normali. PBMC (106/ml) au fost cultivate la 37°C în plăci cu 24 de godeuri care conțin mediu RPMI 1640 și 10% ser fetal bovin inactivat termic. Celulele au fost incubate fie cu SEB (200 ng/ml), fie cu TSST-1 (200 ng/ml) timp de 16 h, iar supernatantele au fost recoltate și analizate pentru IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α și MIP-1β. Citokinele și chemokinele au fost măsurate printr-un test imunoenzimatic cu anticorpi specifici pentru citokine sau chemokine, în conformitate cu instrucțiunile producătorului (15, 17). Pe fiecare placă au fost utilizate citokine și chemokine recombinante umane (20 până la 1 000 pg/ml) ca standarde pentru calibrare. Limita de detecție a fiecărui test a fost de 20 pg/ml. Datele privind citokinele și chemokinele au fost exprimate ca citire medie ± deviația standard (SD) a eșantioanelor duplicate. Doxiciclina, atunci când a fost prezentă, a fost adăugată simultan cu agentul stimulator. Citotoxicitatea a fost măsurată prin eliberarea de lactat dehidrogenază (LDH) din citosol în supernatantul de cultură. LDH a fost cuantificată prin utilizarea unui kit colorimetric de testare a citotoxicității (Boehringer Mannheim), conform instrucțiunilor producătorului. Cantitatea maximă de LDH eliberabilă (100%) a fost obținută prin lizarea celulelor cu 1% Triton X-100. Proliferarea celulelor T a fost testată cu PBMC (105/puț), care au fost placate în triplu exemplar cu SEB sau TSST-1 (200 ng/ml), cu sau fără doxiciclină, timp de 48 h la 37°C în plăci de microtitrare cu 96 de puțuri. Celulele au fost pulsate cu 1 μCi de timidină (New England Nuclear, Boston, Mass.) pe puț în ultimele 5 ore de cultură, așa cum s-a descris anterior (15). Celulele au fost recoltate pe filtre din fibră de sticlă, iar timidina încorporată a fost măsurată prin scintilație lichidă. Toate datele au fost analizate pentru diferențe semnificative prin testul t al lui Student cu Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Diferențele dintre grupurile de control tratate cu doxiciclină și cele netratate au fost considerate semnificative dacă P a fost <0,05.

Pe baza raportului conform căruia doxiciclina a blocat IL-1 indusă de lipopolizaharide în celulele epiteliale și a prevenit endotoxemia letală in vivo (20, 25), am testat ipoteza că acest antibiotic ar putea avea efecte directe asupra citokinelor induse de SE. După cum se arată în Fig. 1, doxiciclina a inhibat în mod dependent de doză producția de citokine IL-1β, IL-6, TNF-α și IFN-γ și de chemokine MCP-1, MIP-1α și MIP-1β de către PBMC incubate cu SEB. O reducere similară dependentă de doză a citokinelor și chemokinelor de către doxiciclină a fost, de asemenea, observată pentru PBMC stimulate de TSST-1 (datele nu sunt prezentate). Efectul inhibitor al doxiciclinei asupra citokinelor și chemokinelor mediate de SEB- sau TSST-1 obținute cu PBMC de la șapte donatori normali este rezumat în Fig. 2. Producția de MCP-1 și IFN-γ a fost complet blocată de 50 μM doxiciclină. Această concentrație de doxiciclină a redus IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α și MIP-1β la 15 până la 22%, 37 până la 41%, 21 până la 25%, 10 până la 15% și, respectiv, 59 până la 61% din cea a celulelor netratate, stimulate cu SEB sau TSST. TNF-β, atunci când a fost prezent, a fost, de asemenea, inhibat la 25% din cel al celulelor netratate și stimulate cu SEB. Doxiciclina nu a fost citotoxică pentru PBMC la această concentrație, după cum s-a măsurat prin excluderea albastru trypan și prin lipsa eliberării de lactat dehidrogenază din celulele tratate. Inhibarea completă a acestor citokine și chemokine a fost observată la doze mari de doxiciclină (>0,1 mM). O inhibiție similară doză-răspuns prin doxiciclină a fost observată la concentrații mai mici de SEB (1 și 10 ng/ml) (datele nu sunt prezentate).

Pentru că superantigenii determină, de asemenea, proliferarea celulelor T, a fost investigat efectul doxiciclinei asupra proliferării celulelor T induse de SE. Figura 3 arată că doxiciclina a inhibat proliferarea celulelor T stimulată de SEB- și TSST-1 într-o manieră dependentă de doză, atingând o inhibiție de 98% la 0,05 mM.

Acest studiu a demonstrat că doxiciclina a inhibat în mod eficient producția de citokine și chemokine mediată de superantigen de către PBMC umane in vitro. Proliferarea celulelor T indusă de superantigeni stafilococici a fost, de asemenea, suprimată complet. Reducerea citokinelor și chemokinelor proinflamatorii de către doxiciclină în PBMC stimulate de SEB- și TSST-1 a sugerat că doxiciclina poate afecta fiziopatologia șocului toxic. Aceste rezultate extind observațiile altor cercetători cu privire la efectele imunomodulatoare ale doxiciclinei pe lângă activitățile sale antimicrobiene.

Multiple mecanisme moleculare, atât transcripționale cât și posttranscripționale, pot fi implicate în efectele antiinflamatorii ale doxiciclinei (11, 26). Suprimarea citokinelor proinflamatorii poate implica reducerea căii PKC de către doxiciclină, așa cum sugerează un studiu al efectelor sale asupra formării granulomului (26). Doza inhibitorie raportată de doxiciclină (10 până la 15 μM) care reduce colagenaza, gelatinaza și alte metaloproteinaze in vitro (10, 11) este comparabilă cu cea utilizată în acest studiu și este de câteva ori mai mare decât cea observată în serul uman după administrarea orală de 200 mg zilnic (10, 24). Cu toate acestea, studiile clinice indică faptul că această doză a fost suficientă pentru a reduce activitățile colagenazei și gelatinazei în extractele de cartilaj osteoartritic uman ex vivo (24). S-a demonstrat că o doză subantimicrobiană de doxiciclină (20 mg de două ori pe zi) a inhibat activitatea colagenazei din lichidul gingival (9). În plus, studiile in vivo ale endotoxemiei experimentale au constatat, de asemenea, că doxiciclina și alte tetracicline sunt eficiente în reducerea citokinelor inflamatorii și în prevenirea șocului (20).

În concluzie, rezultatele prezentate aici indică faptul că doxiciclina reduce citokinele proinflamatorii și chemokinele, sugerând astfel utilitatea sa potențială pentru tratarea șocului toxic indus de superantigeni. Într-un context clinic în care gazda este expusă la mai mulți agenți biologici, incluzând atât bacterii, cât și exotoxine bacteriene, utilizarea doxiciclinei oferă avantajul suplimentar de a oferi atât efecte antimicrobiene, cât și antiinflamatorii.