ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNOSTICUL DEFICIENȚEI DE ALFA-1-ANTITRIPSINĂ PRIN ANALIZA ADN la copii cu afecțiuni hepatice*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 și Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Context – Deficitul de alfa-1-antitripsină este o tulburare genetică care se transmite într-o formă codominantă, autosomală. Deficitul de alfa-1-antitripsină afectează în principal plămânii și ficatul ducând, în acest din urmă caz, la colestază neonatală, hepatită cronică sau ciroză. Un diagnostic precis al deficitului de alfa-1-antitripsină poate fi obținut prin analize biochimice sau moleculare. Obiectiv – Scopul acestui studiu a fost de a utiliza analiza ADN pentru a examina prezența unui deficit de alfa-1-antitripsină la 12 copii suspectați de a avea acest deficit și care prezentau caracteristicile de laborator și clinice ale bolii. Pacienți și metode – Au fost studiați 12 pacienți, cu vârste cuprinse între 3 luni și 19 ani, care prezentau niveluri serice de alfa-1-antitripsină mai mici decât cele normale și/sau prezentau o boală hepatică de etiologie nedefinită. Alelele mutante S și Z ale genei alfa-1-antitripsină au fost investigate la cei 12 copii. Organizarea genei alfa-1-antitripsină a fost analizată prin amplificarea genomului prin reacția în lanț a polimerazei și digestia cu enzimele de restricție Xmnl (alela S) și Taq 1 (alela Z). Rezultate – Șapte dintre cei 12 pacienți prezentau boală hepatică cronică de etiologie nedefinită, iar ceilalți cinci pacienți aveau niveluri serice scăzute de alfa-1-antitripsină, precum și un diagnostic de colestază neonatală și/sau boală hepatică cronică de etiologie nedefinită. Cinci dintre cei 12 pacienți erau homozigoți pentru alela Z (ZZ) și doi aveau alela S cu o altă alelă (*S) diferită de Z. Concluzie – Aceste rezultate arată că deficitul de alfa-1-antitripsină este relativ frecvent la copiii cu boală hepatică cronică de etiologie nedefinită și/sau niveluri scăzute de alfa-1-antitripsină (41,6%). Un diagnostic corect este important pentru o urmărire clinică eficientă și pentru consilierea genetică.

DETALITATEA ¾ Deficitul de alfa-1-antitripsină. Diagnostic molecular. Biopsie hepatică.

INTRODUCERE

Alfa-1-antitripsina (A1AT) este o glicoproteină de 52 kDa produsă în principal de hepatocite, care eliberează 2 g din această proteină, pe zi, în fluxul sanguin(36). Principala funcție a A1AT este aceea de a inhiba acțiunea elastazei neutrofile, o serin-protează care hidrolizează fibrele de elastină din plămâni(38). Mutațiile în gena care codifică pentru A1AT produc o proteină fără capacitate inhibitoare și pot duce la acumularea A1AT în corpusculii de incluziune din hepatocite, reducând astfel nivelurile serice normale ale acestei proteine(4). Această deficiență se reflectă prin emfizem pulmonar, bronșită cronică sau bronșiectazie(9). Acumularea de A1AT mutant în hepatocite poate duce, de asemenea, la colestază neonatală, hepatopatie cronică sau ciroză(33, 34).

Gena A1AT este foarte polimorfă, codominantă și este localizată pe brațul lung al cromozomului 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Șaptezeci¾cinci de alele (denumite A-Z în funcție de punctele lor izoelectrice) au fost descrise pentru această genă pe baza focalizării izoelectrice a serului între pH 4 (anod) și pH 5 (catod) în geluri de poliacrilamidă. Variantele comune migrează spre centrul gelului și, prin urmare, aparțin familiei M („mijloc”). O variantă deficitară, descrisă inițial de LAURELL și ERIKSSON în 1963(21), migrează spre catod și este denumită Z. O altă variantă, care se deplasează lent în gel, este denumită S(5). Acest „locus” polimorf este cunoscut în general sub numele de sistemul Pi (inhibitor de protează). Majoritatea variantelor produc A1AT de cantitate și calitate normală(7, 8, 25). Cu toate acestea, unele alele, cum ar fi variantele S și Z, sunt asociate cu o stare deficitară care atinge frecvențe polimorfe ca populații caucaziene și au fost raportate cazuri de alelă nulă în care producția de proteine este total absentă(10).

Alela S rezultă din înlocuirea adeninei cu tiamina în exonul III al genei, ceea ce duce la schimbarea acidului glutamic de la poziția 264 cu valina și la formarea în consecință a unei structuri proteice instabile(10, 11, 19). Alela Z rezultă din înlocuirea guaninei la poziția 342 cu adenină în exonul V al genei și duce la formarea unei proteine care se adună pe suprafața rugoasă internă a reticulului endoplasmatic al hepatocitelor(6). Diagnosticul unei afecțiuni deficitare se face, de obicei, după cuantificarea nivelurilor serice ale proteinei împreună cu profilul electroforetic după focalizarea izoelectrică(23, 37). Un diagnostic mai precis necesită o analiză genetică prin tehnici bazate pe ADN(12, 14, 26).

Obiectivul acestui studiu a fost de a identifica purtătorii alelei S și Z la pacienții suspectați de a avea acest deficit și care prezentau caracteristicile de laborator și clinice ale acestei boli.

PACIENȚI ȘI METODE

Pacienți

În perioada februarie 1988-august 1997, un număr mare de pacienți au fost trimiși la Serviciul de Gastroenterologie Pediatrică, Universitatea de Stat din Campinas, Campinas, SP, Brazilia, în vederea investigării bolilor hepatice. Din acest număr, doar 12 pacienți nu au prezentat niciun diagnostic cert (rezultate negative la hepatită virală, hepatită autoimună și boala Wilson). Acești pacienți au fost supuși unei analize moleculare a A1AT.

Metode

1 ¾ Protocol de studiu

2 – Biopsie hepatică

Biopsiile hepatice procutanate au fost obținute conform descrierii MOWAT(24), folosind anestezie locală, la pacienți aflați la post de cel puțin 4 h, cu venocliză și activitate normală a protrombinei. Fragmentul obținut a fost plasat imediat în formol 10% și apoi procesat și colorat cu hematoxilină-eozină, tricromic Masson, albastru de Prusia și impregnare cu argint a fibrelor reticulare. Colorarea specială a fost obținută cu ajutorul PAS (acid periodic-Schiff), urmată de un tratament cu diastază. Persistența granulelor citoplasmatice cu aspect de eozinofile chiar și după utilizarea diastazei a fost considerată pozitivă pentru deficitul de A1AT.

3 – Analiză moleculară

Pentru a investiga alelele mutante S și Z ale A1AT, s-a făcut o extracție de ADN din leucocitele din sângele periferic, așa cum se folosește în metoda descrisă de WOODHEAD și colab.(39).

REZULTATE

Cinci din cei 12 copii studiați au fost homozigoți Z (ZZ), în timp ce doi dintre copii au avut alela S împreună cu o altă alelă care nu era Z (*S). Tabelul 1 prezintă vârsta pacientului la momentul recoltării sângelui și indicația folosită pentru a decide pentru analiza ulterioară. Trei dintre pacienți au prezentat colestază neonatală ca o manifestare inițială a hepatopatiei cronice.

Tabelul 2 prezintă nivelurile serice ale ALT, AP, gGT, A1AT, precum și rezultatele studiului molecular și ale biopsiei hepatice.

Cei cinci pacienți cu genotipul ZZ au avut niveluri serice reduse de A1AT, iar biopsia hepatică a evidențiat ciroză (unul), hepatită neonatală (doi), o sărăcie a canalelor biliare interlobulare (unul) și hepatită cronică (unul). În acest ultim caz (FSP), granule citoplasmatice cu aspect de eozinofile au fost observate în hepatocitele periportale în urma colorației cu HE și confirmate posterior prin pozitivitatea PAS și rezistența la diastază (figura 1). Cei doi pacienți cu colestază neonatală (EKBA și RHBP) au fost supuși unei biopsii hepatice la vârsta de 10 săptămâni și, respectiv, 13 săptămâni, și au prezentat globule eozinofile PAS-pozitive și rezistente la diastază.

Figurile 2 și 3 prezintă rezultatele amplificării și digestiei alelelor S și, respectiv, Z.

DISCUȚII

Deficitul de alfa-1-antitripsină este una dintre cele mai frecvente tulburări genetice care duce la afecțiuni hepatice la copii și este cea mai frecventă boală genetică care necesită transplant hepatic(17, 28). Deficitul de A1AT afectează 1 din 1600-2000 de nou-născuți în America de Nord și în Europa de Nord(28, 31), dar doar 10-15% din populația cu acest deficit dezvoltă boli hepatice(32, 33). Conform unui studiu publicat de SVEGER în 1988(33), în perioada neonatală 11% dintre pacienții cu fenotip PIZZ dezvoltă hepatită icterică. În acest studiu, trei pacienți diagnosticați cu un deficit de A1AT au prezentat colestază neonatală, iar la doi dintre aceștia, înainte de stabilirea unui diagnostic cert al deficitului, colestaza a fost considerată idiopatică. Între cinci și 10 la sută dintre cazurile de hepatită neonatală idiopatică raportate în literatura de specialitate sunt cauzate de un deficit de A1AT(3).

La cinci pacienți cu acest deficit studiați, nivelurile serice ale A1AT au fost sub limita inferioară normală. Cu toate acestea, acest test nu a confirmat în mod absolut diagnosticul bolii. Deoarece A1AT este o proteină a fazei inflamatorii acute, sinteza sa crește în condiții inflamatorii/infecțioase, neoplazii, sarcină și în timpul terapiei cu estrogeni și corticosteroizi(16, 22). O reducere a nivelului seric al A1AT apare în sindromul de angoasă respiratorie al nou-născuților, în faza terminală a insuficienței hepatice, în fibroza chistică și în situațiile în care există pierderi mari de proteine(15). Nivelurile serice în cazul genotipurilor SZ, care ar putea teoretic duce la afecțiuni hepatice, sunt de obicei normale.

Când este prezentă colestaza neonatală, este necesar în mod fundamental un diagnostic diferențial cu atrezia biliară extrahepatică. Anamneza clinică permite un diagnostic adecvat în 83% din cazuri(1) și sunt necesare investigații specifice pentru a îmbunătăți acuratețea diagnosticului. Printre aceste investigații, biopsia hepatică are o importanță majoră. Modificările histopatologice observate în biopsia hepatică a pacienților cu deficit de A1AT pot fi aceleași cu cele observate în hepatita neonatală idiopatică sau în cazurile de atrezie biliară extrahepatică(24). Prezența globulelor predominant periportale, intrahepatocistice, care sunt puternic pozitive la PAS după digestia cu diastază, reprezintă o indicație utilă a deficitului de A1AT(13, 18, 27). Cu toate acestea, este dificil de identificat acești globuli înainte de a 12-a săptămână de la naștere(35). În acest studiu, pacientul EKBA avea globule cu caracteristicile de mai sus în țesutul hepatic la vârsta de 10 săptămâni. La pacientul JCI (vârsta de 13 săptămâni) nu s-au observat astfel de globule. Aceste rezultate sugerează că prezența globulelor ar trebui investigată cu ajutorul unei colorații speciale în fragmente hepatice obținute înainte de vârsta de 12 săptămâni, deși un rezultat negativ nu elimină posibilitatea unui deficit de A1AT. Analiza biochimică nu a fost utilizată în acest studiu, deoarece a fost posibilă analiza ADN, care este mai precisă.

Un deficit de A1AT este relativ frecvent la copiii care au o boală hepatică de etiologie nedefinită. Acest diagnostic este subestimat, probabil pentru că se folosesc metode de diagnostic imprecise. Analiza moleculară oferă un diagnostic mai precis și poate fi, de asemenea, utilă pentru consilierea genetică a pacienților cu boală hepatică de etiologie necunoscută.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com enfermedad hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Rațional – Deficiența de alfa-1-antitripsină este o boală genetică transmisă în mod autoscopic co-dominant. Manifestările clinice principale includ acomeția pulmonară și hepatică. Acesta din urmă se prezintă ca și colestase neonatală, hepatită cronică sau ciroză. Diagnosticul definitiv se face prin analiza biochimică a alfa-1-antitripsinei sau prin analiză moleculară. Obiectiv – Investigarea, într-un grup de 12 copii cu suspiciune de deficiență de alfa-1-antitripsină, a prezenței efective a deficienței prin analiza ADN, pentru un diagnostic definitiv, precum și a asocierii dintre deficiențele de alfa-1-antitripsină și caracteristicile clinice și de laborator găsite. Cazuistică și metode – Alelele mutante S și Z ale genei alfa-1-antitripsină au fost investigate la 12 pacienți cu vârste cuprinse între 3 luni și 19 ani, trimiși de Ambulatoriul de Gastroenterologie Pediatrică al Universidade Estadual de Campinas, SP, Brazilia, pentru că prezentau niveluri serice de alfa-1-antitripsină mai mici decât cele normale și/sau boală hepatică fără etiologie definită. Analiza ADN a fost efectuată utilizând metoda modificată de amplificare genetică prin reacția în lanț a polimerazei, care creează situsuri de restricție pentru enzimele Xmnl (alela S) și Taq l (alela Z). Rezultate – Dintre cei 12 pacienți trimiși, 7 aveau o boală hepatică cronică fără etiologie definită, iar ceilalți 5 aveau doze serice scăzute de alfa-1-antitripsină însoțite de un diagnostic de colestază neonatală și/sau boală hepatică cronică de etiologie necunoscută. În acest grup de 12 pacienți, au fost observați cinci pacienți homozigoți Z (ZZ) și doi purtau alela S însoțită de o altă alelă, diferită de Z (*S). Concluzie – Aceste rezultate arată că deficitul de A1AT este o etiologie relativ frecventă la copiii care prezintă o boală hepatică cronică fără etiologie definită și/sau un dozaj scăzut de A1AT seric (41,6%). Importanța unui diagnostic de certitudine pentru această deficiență este justificată nu numai pentru urmărirea clinică a pacientului, ci și în ceea ce privește consilierea genetică.

DESCRITORI ¾ Deficitul de alfa-1-antitripsină. Diagnostic molecular. Biopsie hepatică.

1. Alagille D. Colestaza în primele trei luni de viață. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Two novel nonradioactive polymerase chain reaction-based assays of dried blood spots, genomic DNA, or whole cells for fast, reliable detection of Z and S mutations in the Alpha-1-antitrypsin gene. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Nukiwa T, Crystal RG. Baza moleculară a deficitului de alfa-1-antitripsină. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. Acumularea de alfa 1-antitripsină PiZ provoacă leziuni hepatice la șoarecii transgenici. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. Fragmentele de restricție ADN asociate cu alfa 1-antitripsina indică o singură origine pentru alela de deficiență PI Z. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Gena alfa 1-antitripsină și mutațiile sale. Consecințe clinice și strategii pentru terapie. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Deficiența de alfa-1-antitripsină cauzată de gena alfa-1-antitripsină Nullmattawa. O mutație de inserție care face ca gena alfa-1-antitripsină să fie incapabilă să producă alfa-1-antitripsină. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Analiza rapidă a ADN a deficitului de alfa-1-antitripsină: aplicarea unei metode îmbunătățite de amplificare a secvenței genei mutante. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Caracteristici histopatologice ale bolii hepatice în deficitul de alfa 1-antitripsină. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Electroforeza pe gel în gradient de denaturare a genei alfa 1-antitripsină: aplicație la diagnosticul prenatal. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Concentrațiile serice de inhibitori enzimatici în sindromul de detresă respiratorie. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Morfologia hepatică în bolile metabolice ereditare. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Atribuirea genei alfa 1-antitripsină și a unei gene legate de secvență la cromozomul uman 14 prin hibridizare moleculară. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. The electrophoretic alpha-1-globulin pattern of serum in alpha-1-antitrypsin deficiency. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Efectul administrării unui contraceptiv combinat estrogen-progestativ asupra nivelului proteinelor plasmatice individuale. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alfa 1-antitripsina: moleculară și sistemul Pi. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Detectarea rapidă neradioactivă a mutațiilor în genomul uman prin amplificare specifică alelei. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Manifestări clinice ale deficitului de alfa 1-antitripsină. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificarea moleculară a alelor S și Z ale genei alfa-1-antitripsinei într-un grup de pacienți purtători de boală pulmonară cronică . Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Deficiența de alfa-1-antitripsină. Prevalență ridicată în zona St. Louis determinată prin screening-ul direct al populației. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Boala hepatică în deficitul de alfa 1-antitripsină detectată prin screeningul a 200.000 de sugari. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. Istoria naturală a bolii hepatice la copiii cu deficiență de alfa 1-antitripsină. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Boala hepatică în copilărie. Caracteristici histologice și relația cu fenotipul alfa 1-antitripsină. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Inhibitori ai proteinazei plasmatice umane. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Deficiența de alfa 1-antitripsină: o prezentare generală. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Deficiența terapiei de substituție asociată cu emfizemul. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Studiu realizat de către Departamentele de Pediatrie, Genetică Medicală, Anatomie Patologică și Patologie Clinică ale Facultății de Științe Medicale (FCM), Universitatea de Stat din Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazilia.

1 Student postuniversitar. Departamentul de pediatrie, FCM/UNICAMP.

2 Profesor asistent. Departamentul de patologie clinică, FCM/UNICAMP.

3 Profesor asistent. Departamentul de Anatomie Patologică, FCM/UNICAMP.

4 Doctor în Genetică (Institutul de Biologie), UNICAMP.

5 Profesor asistent. Departamentul de Genetică Medicală, FCM/UNICAMP.

6 Profesor asistent. Departamentul de Pediatrie, FCM/UNICAMP.