Alegerea enzimelor de restricție adecvate pe baza unor criterii definite
Pentru a continua cu un exemplu concis, proteina fluorescentă tdTomato a fost clonată într-un vector alpharetroviral. Consecutiv, a fost generată o linie celulară de leucemie murină care exprimă tdTomato. Această linie celulară va fi utilizată pentru a urmări celulele tumorale la injectarea în șoareci în studiile preclinice de imunoterapie. Cu toate acestea, această metodă de clonare este aplicabilă oricărei alte gene. Pentru a începe proiectul de clonare, trebuie analizată gena de interes (GOI). În primul rând, verificăm dacă secvența noastră adnotată are un codon de început (ATG, cel mai frecvent codon de început) și unul dintre cei trei codoni de oprire (TAA, TAG, TGA). În cazul în care gena a fost manipulată anterior sau fuzionată cu o altă genă (de exemplu, prin intermediul unei secvențe 2A), se întâmplă ca o genă de interes să nu aibă un codon de oprire. În astfel de cazuri, este necesar să se adauge un codon de oprire la sfârșitul secvenței adnotate. De asemenea, este benefic să investigați dacă GOI-ul dumneavoastră conține un cadru de lectură deschis (ORF). Acest lucru este important, deoarece manipularea frecventă a secvențelor, fie prin software, fie prin clonare, ar putea adăuga sau șterge în mod eronat nucleotide. Noi folosim software-ul Clone Manager (SciEd) pentru a găsi ORF-uri în secvențele noastre plasmidice; cu toate acestea, există mai multe site-uri web gratuite pe care le puteți utiliza pentru a găsi ORF-uri, inclusiv NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
Gena tdTomato conține codonul de început ATG și codonul de oprire TAA (figura 1). Dimensiunea genei tdTomato este de 716 pb.
Prezentare generală a începutului și sfârșitului genei de interes. (A) Sunt prezentate secvențele de nucleotide de la începutul și sfârșitul genei tdTomato. Nucleotidele șirului de codificare sunt specificate cu caractere aldine (B) Sunt prezentate secvențele nucleotidice ale primerilor înainte și înapoi care conțin situsurile adecvate ale enzimei de restricție și secvența Kozak.
În etapa următoare, trebuie proiectați primerii PCR care includ situsurile adecvate ale enzimei de restricție pentru amplificarea GOI. Trebuie luate în considerare mai multe criterii pentru a alege enzimele de restricție optime. În primul rând, situsurile de legare pentru enzimele de restricție ar trebui să fie disponibile în mod ideal la un situs de clonare multiplă în cadrul vectorului. Alternativ, acestea pot fi localizate în aval de promotor în secvența vectorului dumneavoastră. Enzimele de restricție ar trebui să fie de tip single cutter (single cutter vizează un singur situs de restricție în cadrul unei secvențe de ADN) (figura 2A). În cazul în care sunt duble sau multiple, acestea ar trebui să taie o secvență care nu este necesară pentru buna funcționare a plasmidului vector și care va fi în cele din urmă eliminată (figura 2B). Este, de asemenea, posibil să se aleagă o singură enzimă dublu tăietoare sau multiple tăietoare care taie vectorul în aval de promotor și, de asemenea, nu în interiorul unei secvențe vitale a plasmidului (figura 2C). Enzimele double cutter sau multiple cutter au două sau mai multe situsuri de restricție pe o secvență de ADN, respectiv. Tăierea vectorului cu enzime de tăiere duble sau multiple ar da naștere la două capete identice. În acest caz, caseta de inserție ar trebui să conțină, de asemenea, aceleași situsuri ale enzimelor de restricție la ambele capete. Prin urmare, atunci când fragmentele inserției și ale vectorului sunt amestecate într-un experiment de ligare, inserția poate fuziona cu vectorul fie în orientarea corectă (de la codonul de pornire la codonul de oprire), fie inversă (de la codonul de oprire la codonul de pornire). Poate apărea un al treilea scenariu, dacă fragmentul de vector formează un cerc de autoligare care omite deloc inserția. După ce ADN-ul a fost incubat cu enzime de restricție, desfosforilarea capetelor 5′ și 3′ ale plasmidului vector cu ajutorul unei enzime fosfataze alcaline va reduce foarte mult riscul de autolegare. Prin urmare, este important să se depisteze un produs de clonare pentru acești trei produse (orientare corectă, orientare inversă, autoligare) după ligarea fragmentului.
Alegerea enzimelor de restricție adecvate pe baza criteriilor definite pentru clonarea PCR. (A) Două enzime de restricție cu un singur tăietor (E1 și E2) sunt amplasate în urma promotorului. (B) Enzimele de restricție E1 și E2 taie plasmidul în aval de promotor de mai multe ori (aici de două ori pentru fiecare enzimă). (C) Enzima de restricție E1 taie plasmidul din aval de promotor de mai multe ori. (D) Produsul PCR, care conține gena tdTomato și situsurile enzimelor de restricție, a fost analizat pe un gel înainte de a fi extras pentru aplicații în aval.
În al doilea rând, datorită eficienței mai mari a clonării folosind fragmente de ADN cu capăt lipicios, este de dorit ca cel puțin una (mai bine ambele) dintre enzimele de restricție să fie un așa-numit „sticky-end cutter”. Cele care taie capetele lipicioase clivează ADN-ul în mod asimetric, generând capete coezive complementare. În schimb, cei care taie capetele blunt taie secvența simetric, fără să lase supraînălțări. Clonarea fragmentelor cu capătul blunt este mai dificilă. Cu toate acestea, alegerea unui raport molar inserție/vector mai mare (5 sau mai mult) și utilizarea a 10% polietilenglicol (PEG) poate îmbunătăți ligarea fragmentelor cu capăt bont.
În al treilea rând, unele enzime de restricție nu taie ADN-ul metilat. Majoritatea tulpinilor de E. coli conțin metilaze Dam sau Dcm care metilează secvențe de ADN. Acest lucru le face rezistente la enzimele de restricție sensibile la metilare. Având în vedere că ADN-ul vector este preparat în cea mai mare parte în E. coli, acesta va fi metilicat. Prin urmare, evitarea enzimelor de restricție sensibile la metilare este de dorit; cu toate acestea, uneori, izoschizomerul unei enzime de restricție sensibile la metilare este rezistent la metilare. De exemplu, enzima Acc65I este sensibilă, în timp ce izoschizomerul său kpnI este rezistent la metilare. Isoschizomerii sunt enzime de restricție care recunosc aceleași secvențe de nucleotide. În cazul în care nu rămâne altă opțiune decât utilizarea enzimelor de restricție sensibile la metilare, ADN-ul vector trebuie preparat în tulpini de E. coli dam – dcm -. O listă a acestor tulpini și, de asemenea, a tulpinilor gazdă obișnuite de E. coli pentru clonarea moleculară este rezumată în tabelul 1. Informațiile cu privire la sensibilitatea la metilare a enzimelor de restricție sunt de obicei furnizate de către producător.
În al patrulea rând, se facilitează clonarea dacă tamponul necesar pentru funcționalitatea completă a enzimelor de restricție este același, deoarece se poate realiza o dublă digestie de restricție. Astfel se economisește timp și se reduce pierderea de ADN în timpul purificării. Se poate întâmpla ca una dintre enzimele de restricție să fie activă într-un tampon, iar cea de-a doua enzimă să fie activă în concentrația dublă a aceluiași tampon. De exemplu, enzima NheI de la Thermo Scientific este activă în tamponul Tango 1X (Thermo Scientific), iar enzima EcoR1 este activă în tamponul Tango 2X (Thermo Scientific). În astfel de cazuri, ADN-ul plasmidic trebuie digerat mai întâi cu enzima care necesită concentrația mai mare a tamponului (aici EcoR1). Aceasta va fi urmată de diluarea tamponului pentru următoarea enzimă (care necesită o concentrație mai mică (aici NheI)) în același tampon. Cu toate acestea, apariția unor tampoane universale a simplificat dubla digestie a secvențelor de ADN. În exemplul nostru, vectorul conține situsurile de restricție AgeI și SalI. Aceste situsuri enzimatice au fost utilizate pentru proiectarea primerilor PCR (figura 1). Pentru o digestie adecvată a enzimelor de restricție este esențial ca puritatea plasmidului să fie ridicată. Absorbția ADN-ului măsurată cu ajutorul unui spectrofotometru poate fi utilizată pentru a determina puritatea după purificare. ADN-ul, proteinele și solvenții absorb la 260 nm, 280 nm și, respectiv, 230 nm. Un raport OD 260/280 de >1,8 și un raport OD 260/230 de 2 până la 2,2 este considerat a fi pur pentru probele de ADN. Rapoartele OD 260/280 și 260/230 ale preparatelor noastre exemplare de plasmidă au fost de 1,89 și, respectiv, 2,22. Am observat că puritatea fragmentelor de ADN de vector și inserție extrase pe gel au fost mai mici după digestia de restricție; ligatura funcționează chiar și în astfel de cazuri, însă se pot aștepta rezultate mai bune folosind fragmente de înaltă puritate.
Site-ul web al depozitului de plasmidă de mai jos poate fi util pentru selectarea diferiților vectori (expresie virală și împachetare, backbones goale, proteine fluorescente, vectori inductibili, etichete epitopice, proteine de fuziune, gene reporter, sisteme de expresie specifice speciilor, markeri de selecție, promotori, expresie shRNA și inginerie genomică):http://www.addgene.org/browse/.
O colecție de vectori de clonare de E. coli este disponibilă pe următorul site web:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Proiectarea primerilor de clonare pe baza unor criterii definite
Pentru proiectarea primerilor PCR, verificați codonii de start și stop ai GOI-ului dumneavoastră. Găsiți secvența enzimelor de restricție dorite (disponibilă pe site-urile web ale producătorilor) pentru primerul forward (figura 3A). Acesta trebuie să fie situat înainte de GOI (figura 1B). Așa-numita secvență Kozak se găsește în ARNm eucariote și îmbunătățește inițierea traducerii. Este benefică adăugarea secvenței Kozak (GCCACC) înaintea codonului de start ATG, deoarece aceasta crește traducerea și expresia proteinei de interes la eucariote. Prin urmare, am inserat GCCACC imediat după secvența AgeI a enzimei de restricție și înainte de codonul de început ATG. Apoi, primele 18 până la 30 de nucleotide ale GOI începând de la codonul de start ATG sunt adăugate la secvența de amorsare directă. Aceste nucleotide suprapuse care se leagă de ADN șablon determină temperatura de recoacere (Tm). Aceasta din urmă este de obicei mai mare de 60°C. În acest caz, folosim ADN polimeraza de înaltă fidelitate Phusion (Thermo Scientific). Puteți utiliza următoarele site-uri web pentru determinarea Tm-ului optim:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Proiectarea de primeri pe baza unor criterii definite pentru clonarea prin PCR. (A-B) Sunt reprezentate secvențele amorselor directe și inverse. Capătul șirului de codificare trebuie să fie convertit în formatul complementului invers pentru proiectarea amorselor inverse. Pentru mai multe informații, vă rugăm să consultați textul.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
Tm-ul primerului nostru forward este de 66°C.
Alegeți ultimele 18 până la 30 de nucleotide, inclusiv codonul de oprire al GOI-ului dumneavoastră pentru proiectarea primerului invers (figura 3B). Calculați apoi Tm pentru această secvență, care ar trebui să fie mai mare de 60°C și apropiată de Tm a amorsării directe. Tm a secvenței suprapuse a primerului nostru invers a fost de 68°C. Apoi, adăugați secvența țintă a celui de-al doilea situs al enzimei de restricție (în acest caz SalI) imediat după codonul de oprire. În cele din urmă, convertiți această secvență asamblată într-o secvență complementară inversă. Următoarele site-uri web pot fi utilizate pentru a determina secvența amorsă inversă:
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis este importantă deoarece amorsă inversă se leagă de șirul de codificare și, prin urmare, secvența sa (5′ → 3′) trebuie să fie invers-complementară cu secvența șirului de codificare (figura 1A).
Realizarea PCR folosind polimeraze de corecție
Din moment ce reacția PCR urmează amplificarea logaritmică a secvenței țintă, orice eroare de replicare în timpul acestui proces va fi amplificată. Rata de eroare a ADN polimerazelor de ADN care nu fac proofreading, cum ar fi polimeraza Taq, este de aproximativ 8 × 10-6 erori/bp/ciclu PCR; cu toate acestea, enzimele proofreading, cum ar fi polimeraza Phusion, au o rată de eroare raportată de 4,4 × 10-7 erori/bp/ciclu PCR. Datorită fidelității și procesivității sale superioare, în acest exemplu a fost utilizată polimeraza ADN Phusion. Trebuie remarcat faptul că Phusion are cerințe de temperatură diferite față de alte ADN polimeraze. Tm-ul amorselor pentru Phusion este calculat pe baza metodei Breslauer și este mai mare decât Tm-ul care utilizează polimerazele Taq sau pfu. Pentru a avea rezultate optime, Tm trebuie calculată pe baza informațiilor găsite pe site-ul web al furnizorilor de enzime. În plus, datorită vitezei mai mari a Phusion, 15 până la 30 de secunde sunt de obicei suficiente pentru amplificarea fiecărui kb al secvenței de interes.
După PCR, produsul trebuie încărcat pe un gel (figura 2D). Banda corespunzătoare trebuie să fie tăiată și ADN-ul extras. Este esențial să se secvențieze produsul PCR, deoarece produsul PCR poate include mutații. Sunt disponibile mai multe kituri de clonare PCR, dintre care unele sunt prezentate în tabelul 2. Noi am utilizat vectorul de clonare pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, publicație de brevet: US 2009/0042249 A1, număr de acces Genbank EF694056.1) și am clonat produsul PCR în vectorul liniarizat. Acest vector conține o genă letală (eco47IR) care este activată în cazul în care vectorul se circularizează. Cu toate acestea, în cazul în care produsul PCR este clonat în situsul de clonare din cadrul genei letale, aceasta din urmă este întreruptă, permițând bacteriilor să dezvolte colonii la transformare. Vectorii circularizați care nu conțin produsul PCR exprimă gena toxică, care, prin urmare, ucide bacteriile împiedicând formarea de colonii. Clonele bacteriene urmează să fie apoi cultivate, ADN-ul plasmidic să fie izolat consecutiv și secvențiat. Calitatea plasmidului izolat este esențială pentru rezultate optime de secvențiere. Am izolat ADN-ul plasmidic dintr-un total de 1,5 ml de bacterii cultivate (randament 6 μg ADN; DO 260/280 = 1,86; DO 260/230 = 2,17) utilizând un kit de mini-preparare a plasmidelor (QIAGEN). Întregul proces de PCR, inclusiv clonarea produsului PCR în vectorul de secvențiere și transfecția bacteriilor cu vectorul de secvențiere se poate realiza într-o singură zi. A doua zi, clonele bacteriene vor fi cultivate peste noapte înainte de a fi trimise pentru secvențiere.
Analiza datelor de secvențiere
Companii de secvențiere raportează în mod normal datele de secvențiere ca fișier FASTA și, de asemenea, ca secvențe de nucleotide pregătite prin e-mail. Pentru analiza secvențelor, pot fi utilizate următoarele site-uri web:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Aici ne vom concentra asupra primului site web. Pe pagina acestui site web, faceți clic pe opțiunea „nucleotide blast” (Figura 4A). Se deschide o nouă fereastră. În mod implicit, opțiunea „blastn” (blast nucleotide sequences) este marcată (Figura 4B). Apoi bifați caseta din spatele „Align two or more sequences” (Aliniați două sau mai multe secvențe). Acum vor apărea două casete. În caseta „Enter Query Sequence” (caseta de sus), introduceți secvența dorită a genei dvs. de interes, care este flancată de situsurile de restricție pe care le-ați proiectat deja pentru amorsele PCR. În caseta „Enter Subject Sequence” (caseta inferioară), introduceți secvența sau încărcați fișierul FASTA pe care l-ați primit de la compania de secvențiere. Apoi faceți clic pe butonul „BLAST” din partea de jos a paginii. După câteva secunde, rezultatele vor fi afișate pe o altă pagină. O parte din datele de aliniere este prezentată în figura 4C. Pentru interpretare, trebuie luate în considerare următoarele puncte: 1) numărul de nucleotide identice (indicat la rubrica „Identities”) trebuie să fie egal cu numărul de nucleotide al genei dvs. de interes. În exemplul nostru, numărul de nucleotide ale genei tdTomato împreună cu cele ale situsurilor enzimelor de restricție și ale secvenței Kozak a fost de 735. Acest număr este egal cu cel raportat (figura 4C). 2) Identitatea secvenței (la rubrica „Identities”) ar trebui să fie de 100%. Ocazional, identitatea secvenței este de 100%, dar numărul de nucleotide identice este mai mic decât cel așteptat. Acest lucru se poate întâmpla dacă unul sau mai multe nucleotide inițiale sunt absente. Nu uitați că toate tehnologiile de secvențiere au o rată de eroare. Pentru secvențierea Sanger, această rată de eroare este raportată ca fiind cuprinsă între 0,001% și 1%. Substituția, deleția sau inserția de nucleotide poate fi identificată prin analizarea rezultatelor secvențierii. Prin urmare, în cazul în care identitatea secvenței nu atinge 100%, plasmidul ar trebui resecvențiat pentru a diferenția erorile de PCR de simplele erori de secvențiere. 3) Lacunele (la rubrica „Gaps”) nu ar trebui să fie prezente. În cazul în care apar lacune, plasmidul trebuie resecvențiat.
Analiza secvențială a produsului PCR utilizând platforma NCBI BLAST. (A) Pe pagina web NCBI BLAST, se alege opțiunea „nucleotide blast” (marcată de linia ovală). (B) Opțiunea „blastn” apare în mod implicit (marcată de cerc). Secvența genei de interes (flancată de situsurile de restricție, așa cum au fost proiectate anterior pentru amorsele PCR) și produsul PCR trebuie introduse în căsuțele „Enter Query Sequence” și „Enter Subject Sequence”. Secvențele pot fi, de asemenea, încărcate ca fișiere FASTA. (C) Este prezentată alinierea nucleotidelor din primele 60 de nucleotide. Două elemente importante pentru analiza secvenței sunt marcate prin linii ovale.
Lungimea medie a unei citiri, sau lungimea de citire, este de cel puțin 800 până la 900 de nucleotide pentru secvențierea Sanger. Pentru vectorul pJET este necesar să se utilizeze un primer înainte și unul invers pentru secvențierea genei complete. Acești amorsori pot acoperi în mod normal o dimensiune a genei de până la 1800 bp. În cazul în care dimensiunea unei gene este mai mare de 1800, trebuie proiectat un primer suplimentar pentru fiecare 800 de nucleotide suplimentare. Deoarece apelarea fiabilă a bazelor nu începe imediat după amorsă, ci la aproximativ 45-55 nucleotide în aval de amorsă, următoarea amorsă trebuie proiectată pentru a începe după aproximativ 700 de nucleotide de la începutul genei. Diferite site-uri web, inclusiv următoarele, pot fi folosite pentru a proiecta acești amorse:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Cu o lungime de 735 pb, dimensiunea produsului PCR din acest exemplu s-a încadrat bine în intervalul amorselor de secvențiere pJET.
După alegerea clonei verificate din punct de vedere al secvenței, plasmidele vector și inserție au fost digerate cu enzimele de restricție AgeI și SalI (figura 5). Aceasta a fost urmată de purificarea pe gel și ligatura fragmentelor. Transformarea E. coli competent cu amestecul de ligare a produs mai multe clone care au fost analizate cu ajutorul enzimelor de restricție. Am evaluat opt clone, dintre care toate conțineau inserția tdTomato (figura 6). Este important să se aleagă clonele care sunt mari. Este posibil ca clonele satelit să nu aibă construcția corectă. Am utilizat un kit de mini-preparare rapidă a plasmidelor (Zymo Research) pentru a extrage plasmidul din 0,6 ml de suspensie bacteriană. Randamentul și puritatea au fost satisfăcătoare pentru screeningul bazat pe enzima de restricție (2,3 μg ADN; DO 260/280 = 1,82; DO 260/230 = 1,41). Pentru purificarea plasmidelor pe scară largă, s-a utilizat un kit de maxi-preparare (QIAGEN) pentru a extrage plasmidul din 450 ml de cultură bacteriană (randament 787 μg ADN; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). Randamentul așteptat al izolării unei plasmide derivate din pBR322 din 1,5 ml și 500 ml de cultură bacteriană este de aproximativ 2-5 μg și, respectiv, 500-4000 μg de ADN.
Hărți ale vectorilor și plasmidelor de inserție A) Ilustrație a plasmidului CloneJET care conține produsul PCR. Inserția produsului PCR în situsul de clonare al plasmidului întrerupe integritatea genei toxice eco47IR și permite creșterea clonelor transgene pozitive. Plasmidul a fost tăiat cu enzimele AgeI și SalI, generând două fragmente de 3 kb și 0,7 kb. Fragmentul de 0,7 kb (gena tdTomato) a fost utilizat ca inserție pentru clonare. (B) Ilustrație a plasmidului vector. Plasmidul a fost tăiat cu enzimele AgeI și SalI, generând două fragmente de 4,9 kb și 0,7 kb. Fragmentul de 4,9 kb a fost utilizat ca vector pentru clonare. AMP: Gena de rezistență la ampicilină; PRE: element reglator posttranscripțional; MPSV: promotor al virusului sarcomului mieloproliferativ.
Screening al plasmidului final cu enzime de restricție. Este prezentată ilustrația plasmidului final. Pentru screening, plasmidul a fost tăiat cu enzima BsiwI, generând două fragmente cu dimensiuni de 4,8 kb și 0,8 kb. AMP: Gena de rezistență la ampicilină; PRE: element reglator posttranscripțional; MPSV: promotor al virusului sarcomului mieloproliferativ.
Câteva plasmide au tendința de a se recombina în interiorul gazdei bacteriene, creând inserții, deleții și recombinări. În aceste cazuri, utilizarea unui E. coli cu deficit de recA poate fi utilă (tabelul 1). În plus, în cazul în care IGI este toxică, incubarea bacteriilor la temperaturi mai scăzute (25-30°C) și utilizarea tulpinilor ABLE C sau ABLE K ar putea evita problema.
Pentru a investiga expresia in vitro a genei clonate, celulele HEK293T au fost transfectate cu plasmide care codifică gena tdTomato, Gag/Pol alfa-aretroviral și învelișul glicoproteinei virusului stomatitei veziculare (VSVG). Aceste celule, care sunt derivate din rinichi embrionar uman, sunt ușor de cultivat și ușor de transfectat. Prin urmare, acestea sunt utilizate pe scară largă în biotehnologie și în terapia genică pentru a genera particule virale. Celulele HEK293T trebuie divizate o dată la două zile folosind mediu cald. Pentru rezultate optime, acestea nu trebuie să atingă o confluență de 100%. Pentru a avea o bună eficiență a transfecției, aceste celule trebuie cultivate timp de cel puțin o săptămână pentru a fi în fază logaritmică. Eficiența transfecției a fost de 22%, determinată pe baza expresiei tdTomato prin microscopie cu fluorescență 24 de ore mai târziu (figura 7A-B). Pentru a genera o linie celulară de leucemie murină care să exprime gena tdTomato pentru studii de imunoterapie, celulele leucemice C1498 au fost transcedate cu virusul proaspăt recoltat (36 de ore de la transfecție). Studiile de imagistică (figura 7C) și analiza citometrică de flux (figura 7D) la patru zile după transducție au confirmat expresia tdTomato în majoritatea celulelor.
Evaluarea expresiei in vitro a genei clonate. (A, B) Celulele HEK293T au fost transfectate cu plasmidele Gag/Pol, VSVG și tdTomato. Expresia genei tdTomato a fost evaluată cu ajutorul unui microscop cu fluorescență. Imaginile fluorescente au fost suprapuse peste o imagine în câmp luminos pentru diferențierea celulelor transcedate pozitiv. Eficiența transfecției a fost determinată pe baza expresiei tdTomato după 24 de ore. Celulele HEK293T netransfectate au fost utilizate ca martori (histograma albastră). (C, D) Linia celulară de leucemie murină C1498 a fost translucidată cu virus proaspăt. Patru zile mai târziu, expresia transgenei a fost evaluată prin microscopie cu fluorescență (C) și citometrie de flux (D). Celulele C1498 netransduse au fost utilizate ca martori (histograma albastră). Barele de scară reprezintă 30 μm.
.
Lasă un răspuns