Alelele mutante Trp53 null și R270H au efecte comparabile în reglarea invaziei, metastazelor și expresiei genice în tumorigeneza colonului de șoarece

Mutațiile Trp53 missense și null promovează progresia tumorilor de colon de șoarece la CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , șoareci Kras LSL-G12D (AK)

Pentru a dezvolta un model de tumoră de colon de șoarece instigat de defecte genetice precum cele prezente adesea în tumorile de colon umane, am generat șoareci mutanți compuși care poartă o alelă Apc floxată (Apcflox, 580S, prescurtat A) care ar putea fi inactivată prin funcția de recombinație Cre și o alelă floxată, latent oncogenă a Kras (KrasLSL-G12D, prescurtat K) care ar putea fi activată prin recombinare Cre. Utilizând transgenul CDX2P-CreERT2 și tratamentul cu TAM pentru a activa funcția Cre în celulele epiteliale ale colonului, am țintit alelele Apc și Kras în epiteliul ileonului distal, al cecumului și al colonului. În timp ce șoarecii CDX2P-CreERT2 K prezintă un epiteliu zimțat și hiperplazic al colonului , șoarecii CDX2P-CreERT2AK (AK) au avut un epiteliu zimțat și hiperplazic al colonului și au dezvoltat, de asemenea, o medie de 13 adenoame cu dimensiuni cuprinse între 0,5 mm și 2 mm în momentul în care au fost atinse punctele finale umane pentru șoareci la 10-15 luni după tratamentul cu TAM (Fig. 1a). La șase din 10 șoareci AK, am găsit unul sau două adenocarcinoame apărute în cecum. Din totalul de opt adenocarcinoame descoperite la cei 10 șoareci AK studiați, șapte tumori au invadat musculatura proprie (MP) sau mai adânc, iar cinci au ajuns în subserosa sau seroasă (Fig. 1b, Tabelul 1 și Tabelul suplimentar 1). Cu toate acestea, deoarece doar 8 din cele 131 de tumori observate la șoarecii AK au fost invazive, constatările implică faptul că defecte somatice suplimentare în afară de mutațiile Apc și Kras au fost necesare pentru dezvoltarea tumorilor invazive ale colonului la șoarecii AK.

Mutațiile Trp53 disense și nule promovează progresia tumorilor de colon la șoareci la șoarecii CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK). a Curbele de supraviețuire Kaplan-Meier ale șoarecilor CDX2P-CreERT2AK (AK) (n = 10, supraviețuire mediană = 336 zile), șoareci CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) (n = 16, supraviețuire mediană = 166 zile), șoareci CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) (n = 16, supraviețuire mediană = 97 de zile) și șoareci CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) (n = 20, supraviețuire mediană = 88 de zile). TAM a fost administrat zilnic timp de două zile, iar timpul zero reprezintă a doua dintre aceste zile. Valorile P au fost obținute prin testul log-rank în următoarele comparații: P = 1,4E-6 pentru AK vs. AKP270/+; P = 1,4E-7 pentru AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1,9E-8 pentru AKP270/fl vs. AKP270/+. b Procentul de tumori de colon cu diferite adâncimi de invazie de la șoarecii AK, șoarecii AKP270/+, șoarecii AKPfl/fl și șoarecii AKP270/fl. Datele provin de la mai multe leziuni pe șoarece (n = 10-14 șoareci pe grup). Valorile P pe baza testelor Fisher Exact și a testelor Poisson Exact sunt prezentate în tabelul 1 și, respectiv, în tabelul suplimentar 1. Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei. A adenom, SM submucoasă, MP musculoasă proprie, SS subseroasă, S seroasă. c, d Sunt prezentate colorațiile cu hematoxilină și eozină (H&E) ale tumorilor invazive reprezentative din țesuturile de colon proximal (dreapta) și cecum (stânga) pentru șoarecii AKP270/fl (c) și AKPfl/fl (d). Tumorile din (c) și (d) au fost colectate la 3 luni după injectarea TAM. Imaginile cu mărire mare sunt prezentate în panourile de jos și sunt încadrate în zonele cu mărire mai mică în panourile de sus corespunzătoare. Liniile punctate indică limita dintre stratul muscular și subserosa. Bare de scară: 500 μm pentru imaginea cu mărire redusă (panourile de sus); 100 μm pentru imaginile cu mărire mare (panourile inferioare)

După cum s-a menționat mai sus, mutațiile TP53 se găsesc în aproximativ 60% din CCR umane și par a fi selectate în timpul progresiei adenomului-carcinomului . Am căutat să evaluăm cooperarea inactivării Trp53 cu mutațiile Apc și Kras în progresia tumorilor de colon in vivo, precum și să determinăm dacă potențialele efecte GOF ale unei alele mutante missense Trp53 ar putea fi observate în acest model. Am introdus o alelă mutantă constitutivă Trp53R270H (echivalentul murin al R273H uman, denumită P270) și/sau o alelă nulă condiționată Trp53flox (denumită Pfl) în modelul AK. Au fost generați șoareci cu genotipuri compuse, iar abrevierile acestora sunt după cum urmează: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (șoareci AKP270/+), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (șoareci AKP270/fl) și CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (șoareci AKPfl/fl). Cohortelor de șoareci adulți AKP270/+, AKP270/fl și AKPfl/fl li s-au indus tumori de colon prin tratament cu TAM, iar starea lor de sănătate a fost monitorizată. În comparație cu șoarecii AK (supraviețuire mediană = 336 zile), șoarecii AKP270/+, AKP270/fl, AKPfl/fl au avut cu toții o durată de viață semnificativ mai scurtă. Șoarecii AKP270/fl și AKPfl/fl au avut supraviețuiri mediane de 88 și, respectiv, 97 de zile, iar șoarecii AKP270/+ au avut o supraviețuire mediană de 166 de zile (Fig. 1a). Șoarecii AKP270/+ au avut o supraviețuire semnificativ mai lungă decât șoarecii AKP270/fl și AKPfl/fl (P < 0,0001 pentru fiecare în comparație cu șoarecii AKP270/+), dar nu s-a observat nicio diferență de supraviețuire semnificativă din punct de vedere statistic atunci când s-au comparat șoarecii AKP270/fl și AKPfl/fl (Fig. 1a). Adăugarea mutației (mutațiilor) Trp53 (R270H sau nulă) a crescut semnificativ incidența globală a tumorilor în raport cu cea observată la șoarecii AK (P < 0,0001 atât pentru AKPfl/fl, cât și pentru AKP270/fl, în comparație cu șoarecii AK, Tabelul suplimentar 1, stânga jos). Șoarecii AKP au avut, de asemenea, mai multe tumori de colon și de cecum care au manifestat caracteristici invazive (7,3 și 8,9 tumori invazive pe șoarece pentru șoarecii AKPfl/fl și, respectiv, AKP270/fl), comparativ cu șoarecii AK (0,8 tumori invazive pe șoarece; Fig. 1b și Tabelul suplimentar 1 dreapta sus, P < 0,0001 atât pentru AKPfl/fl, cât și pentru AKPfl/fl vs. AKP270/fl, în comparație cu AKP270/fl. AK și AKP270/fl vs. AK).

Analiza în profunzime a țesuturilor de cecum și colon ale șoarecilor obținute la necropsie a definit încărcătura tumorală extinsă la șoarecii AKP270/+, AKPfl/fl și AKP270/fl, cu leziuni care variază de la adenoame la adenocarcinoame în stadiu avansat (Fig. 1b-d și Tabelul 1). Toți șoarecii AKP270/+, AKPfl/fl și AKP270/fl studiați au fost purtători a cel puțin un adenocarcinom (tumori cu invazie submucoasă sau mai profundă). Dovezi de invazie în mușchiul neted și, în unele cazuri, în seroasă au fost găsite atât în cecum, cât și în regiunile proximale ale colonului la șoarecii AKP270/fl și AKPfl/fl (Fig. 1c, respectiv d). Șoarecii AKP270/+, la care celulele epiteliale țintite de Cre păstrează inițial o alelă funcțională Trp53 de tip sălbatic, au avut o perioadă de latență mai lungă pentru dezvoltarea tumorii, iar încărcătura tumorală totală (18,5 per șoarece) și procentele de tumori cu invazie mai profundă (11.9 %) au fost semnificativ mai mici în comparație cu șoarecii AKP270/fl sau AKPfl/fl (tabelul suplimentar 1 și tabelul 1, P < 0,01 în comparație cu șoarecii AKP270/fl sau AKPfl/fl pentru încărcătura tumorală pe șoarece și procentele de adenocarcinoame). Aceste constatări susțin noțiunea că p53 de tip sălbatic are o funcție supresoare de tumori în tumorigeneza colonului chiar și în contextul unei alele mutante cu sens greșit Trp53. Atunci când toate tumorile observate au fost comparate între șoarecii AKP270/fl și AKPfl/fl, am constatat că proporția de adenocarcinoame cu invazie submucoasă sau mai profundă a fost mai mare la șoarecii AKP270/fl decât la șoarecii AKPfl/fl (36,9 % și 26,1 % pentru șoarecii AKP270/fl și, respectiv, AKPfl/fl; Tabelul 1, P = 0,0026), sugerând un posibil efect modest GOF pentru alela R270H Trp53 în creșterea invaziei tisulare. Cu toate acestea, creșterea modestă a potențialului invaziv la șoarecii AKP270/fl poate fi compensată, deoarece încărcătura tumorală medie pe șoarece a avut o tendință mai mare la șoarecii AKPfl/fl decât la șoarecii AKP270/fl (28,0 vs 24,2 pe șoarece, P = 0.054; Tabelul suplimentar 1), iar șoarecii AKPfl/fl și AKP270/fl nu au prezentat diferențe semnificative în ceea ce privește incidența adenocarcinoamelor (7,3 vs. 8,9 adenocarcinoame pe șoarece, Tabelul suplimentar 1 dreapta sus, P = 0,16). Mai mult, invazia unor tumori în musculatura proprie, subserosa sau seroasă a fost observată atât la șoarecii AKP270/fl, cât și la șoarecii AKPfl/fl (Fig. 1b și Tabelul 1). Deoarece doar aproximativ 30 % din tumorile provenite de la șoarecii AKP270/fl sau AKPfl/fl au progresat în adenocarcinoame în timpul perioadei de studiu, alte modificări somatice în afară de defectele Apc, Kras și Trp53 sunt probabil esențiale în generarea de carcinoame la șoarecii AKP.

Histologie tumorală și metastaze la șoarecii AKP270/fl sau AKPfl/fl

Care dintre șoarecii AKP270/fl și AKPfl/fl a dezvoltat unul sau mai multe adenocarcinoame în momentul în care au fost atinse punctele finale umane. La șoarecii AKP270/fl, mai mult de 80 % dintre adenocarcinoame prezentau caracteristici bine sau moderat diferențiate, cu înmuguriri/rotiri tumorale la nivelul frontului de invazie și secreție ocazională de mucină (Fig. 2a, sus). Aproximativ 15-20% dintre adenocarcinoamele AKP270/fl erau slab diferențiate, cu morfologie solidă de tip trabecular (Fig. 2a, mijloc). La șoarecii AKP270/fl au fost observate rare carcinoame cu celule signet-ring (Fig. 2a, jos). La șoarecii AKPfl/fl, aproximativ 50% dintre adenocarcinoame erau bine sau moderat diferențiate, cu secreție de mucină (Fig. 2b, sus); restul erau slab diferențiate (Fig. 2b, jos). În tumorile invazive AKP270/fl și AKPfl/fl s-a observat o puternică colorare nucleară și citoplasmatică a β-cateninei (Fig. 2, mijloc), în concordanță cu semnalizarea Wnt defectuoasă rezultată din inactivarea Apc. În celulele tumorale AKP270/fl s-a observat o colorare nucleară puternică pentru p53. După cum era de așteptat, nu s-a observat nicio colorare a p53 în celulele tumorale AKPfl/fl (Fig. 2, dreapta).

Tipurile histologice de adenocarcinoame de colon de la șoarecii mutanți p53. Sunt prezentate colorațiile H&E (panourile din stânga) și colorațiile imunohistochimice pentru β-catenină (panourile din mijloc) și p53 (panourile din dreapta) pentru tumori de colon independente de tipuri histologice reprezentative de la șoarecii AKP270/fl (a) și șoarecii AKPfl/fl (b). Tumorile au fost colectate la 3 luni după inducerea TAM. Bare de scară: 50 μm

La necropsie, s-au găsit metastaze ale ganglionilor limfatici la 3 din 13 șoareci AKPfl/fl și la 5 din 14 șoareci AKP270/fl (Tabelul 2). Dintre cei trei șoareci AKPfl/fl care au avut fiecare o metastază la un ganglion limfatic abdominal, un șoarece avea, de asemenea, metastaze multiple la plămâni și un alt șoarece avea metastaze multiple la ficat (tabelul 2). Dintre cei cinci șoareci AKP270/fl care aveau fiecare câte o metastază la un ganglion limfatic abdominal, un șoarece avea metastaze multiple la plămâni și un altul avea leziuni metastatice atât la plămâni, cât și la ficat (tabelul 2). Nu s-au găsit leziuni metastatice la șoarecii AK sau AKP270/+ (tabelul 2). Datele noastre indică faptul că CCR de șoarece cu mutații missense sau nule în Trp53 pot da naștere la metastaze spontane la ganglionul limfatic și la distanță la frecvențe comparabile, argumentând împotriva unui efect GOF pentru mutațiile missense Trp53 în creșterea metastazelor în modelul nostru de CCR de șoarece.

Tranziția epitelială-mesenchimală în CCR metastatice cu Trp53 missense sau zero

În depozitele metastatice individuale la nivelul ganglionilor limfatici găsite la fiecare dintre cei cinci șoareci AKP270/fl diferiți, patru leziuni au prezentat adenocarcinom moderat diferențiat și o leziune a fost slab diferențiată (Fig. 3a, b, panourile superioare). Toate leziunile metastatice moderat diferențiate la nivelul ganglionilor limfatici prezentau o colorare nucleară puternică a β-cateninei, precum și o colorare puternică a membranei pentru E-cadherină și o colorare absentă a vimentinei (Fig. 3a), sugerând păstrarea proprietăților epiteliale în celulele metastatice AKP270/fl care au păstrat caracteristici moderat diferențiate. La unul dintre șoarecii AKP270/fl la care metastaza ganglionului limfatic avea caracteristici slab diferențiate, s-au găsit leziuni de adenocarcinom cu morfologie slab diferențiată și în plămâni, ficat și cecum (Fig. 3b și Fig. Suplimentară 1). Leziunea slab diferențiată din cecum și leziunile metastatice au prezentat o puternică colorație nucleară a β-cateninei și pierderea expresiei E-cadherinei și o puternică expresie a vimentinei, în concordanță cu caracteristicile tranziției epiteliale-mesenchimale (EMT) (Fig. 3b și Fig. Suplimentară 1). Toate leziunile metastatice la șoarecii AKP270/fl s-au colorat pozitiv pentru CDX2 (Fig. Suplimentară 2), în concordanță cu originea lor epitelială colonică.

Tumorile metastatice derivate din colon cu mutații Trp53 missense pot suferi o tranziție epitelială-mesenchimală (EMT). Fotomicrografii ale secțiunilor colorate cu H&E care arată metastazele ganglionare și pulmonare găsite la doi șoareci AKP270/fl reprezentativi (a, b, panourile superioare). Colorații imunohistochimice care arată o puternică expresie nucleară a β-cateninei, o puternică expresie membranară a E-cadherinei și absența expresiei vimentinei pentru leziunile moderat diferențiate găsite la un șoarece reprezentativ (a, trei panouri inferioare). În schimb, leziunile slab diferențiate găsite la un alt șoarece (b) prezintă o puternică expresie nucleară a β-cateninei, pierderea expresiei E-cadherinei și o puternică expresie a vimentinei, ceea ce indică faptul că leziunile metastatice găsite la acest șoarece au suferit EMT (b, trei panouri de jos). Fotomicrografiile reprezentative ale secțiunilor colorate cu H&E au fost prezentate cu mărire la putere mică pentru orientare; secțiunile în serie au fost supuse colorării imunohistochimice, iar zona casetată cu colorări pentru β-catenină, E-cadherină și vimentină a fost prezentată cu mărire la putere mare. Barele de scară: 20 μm pentru toate imaginile

Două dintre cele trei metastaze ganglionare limfatice de la șoareci purtători de tumori AKPfl/fl au fost moderat diferențiate și una a fost slab diferențiată (Fig. 4a, b, panourile superioare). Șoarecele AKPfl/fl cu metastaze hepatice a avut o metastază ganglionară moderat diferențiată. La acest șoarece cu metastaze hepatice, adenocarcinomul primar de colon cu indice prezumtiv, precum și leziunile metastatice ganglionare limfatice și hepatice au prezentat toate o puternică expresie nucleară a β-cateninei și o puternică expresie membranară a E-cadherinei (Fig. suplimentară 3). La un singur șoarece AKPfl/fl cu o metastază slab diferențiată la nivelul ganglionului limfatic, s-au găsit, de asemenea, multiple leziuni cu morfologie similară în plămânul acestuia (Fig. 4b). Studiile imunohistochimice au arătat că leziunile metastatice pulmonare și adenocarcinomul primar de indice prezumtiv din cecum aveau toate o expresie nucleară puternică a β-cateninei și o expresie redusă a E-cadherinei și o expresie puternică a vimentinei, în concordanță cu EMT în cancerul primar și în celulele metastatice (Fig. 4b). Leziunile metastatice la șoarecii AKPfl/fl au fost toate CDX2-pozitive (Fig. suplimentară 4). Luate împreună, datele noastre indică faptul că nu există nicio diferență semnificativă în ceea ce privește caracteristicile histologice ale leziunilor metastatice apărute la șoarecii AKP270/fl sau la șoarecii AKPfl/fl, iar subsetul slab diferențiat al tumorilor primare și al leziunilor metastatice cu mutații missense sau zero Trp53 poate manifesta caracteristici EMT.

Tumorile metastatice derivate din colon cu mutații Trp53 nule pot suferi o tranziție epitelială-mesenchimală (EMT). a Fotomicrografie a unei secțiuni colorate cu H&E care arată o leziune tumorală moderat diferențiată găsită în ganglionul limfatic al unui șoarece AKPfl/fl reprezentativ la 2,5 luni după injectarea TAM (panoul superior). Colorațiile imunohistochimice pentru această leziune arată o puternică expresie nucleară a β-cateninei, o puternică expresie membranară a E-cadherinei și absența expresiei vimentinei (cele trei panouri inferioare). b Fotomicrografii ale secțiunilor colorate cu H&E care arată leziunile slab diferențiate găsite în cecum, ganglionul limfatic și plămânul unui alt șoarece AKPfl/fl la 4 luni după injectarea TAM (panoul de sus). Toate aceste leziuni prezintă o expresie nucleară puternică a β-cateninei, pierderea expresiei E-cadherinei și o expresie puternică a vimentinei, ceea ce indică faptul că leziunile primare și metastatice găsite la acest șoarece au suferit EMT (cele trei panouri de jos). Fotomicrografiile reprezentative ale secțiunilor colorate cu H&E au fost prezentate cu mărire la putere mică pentru orientare; secțiunile în serie au fost supuse colorării imunohistochimice, iar zona casetată cu colorări pentru β-catenină, E-cadherină și vimentină a fost prezentată cu mărire la putere mare. Barele de scară: 20 μm pentru toate imaginile

Stabilizarea proteinei p53 mutant missense este asociată cu pierderea p53 de tip sălbatic și cu progresia bolii

Majoritatea tumorilor umane cu mutații missense TP53 au fost raportate ca prezentând pierderea de heterozigozitate (LOH) a TP53 , iar un studiu a indicat că TP53 LOH este o condiție prealabilă pentru stabilizarea p53 mutant missense atât în sarcoamele de șoarece, cât și în carcinoamele mamare . Am evaluat modelele de colorare a p53 în diferite stadii de dezvoltare tumorală la șoarecii AKP270/+ după inducerea tumorigenezei prin injectarea de TAM, deoarece epiteliul colonului țintit de Cre la șoarecii AKP270/+ are inițial o alelă Trp53 funcțională. În polipii hiperplastici la șoarecii AKP270/+, unde Kras este activat și unde Apc LOH nu a avut loc încă, colorarea p53 este nedetectabilă (Fig. 5b, panoul HP), asemănătoare cu colorarea negativă pentru p53 observată în epiteliul șoarecilor de tip sălbatic (Fig. 5a), chiar dacă proteina mutantă p53 R270H missense este exprimată în mod constituțional în țesuturile de colon ale șoarecilor AKP270/+. O anumită imunoreactivitate p53 a fost clar observată în adenoame (Fig. 5b, panou adenom și Tabelul 3, n = 185) și carcinoame (Fig. 5c și Tabelul 3, n = 28) apărute la șoarecii AKP270/+. Printre aceste tumori, 94% dintre adenoame și 43% dintre carcinoame au prezentat o colorare slabă a p53 (Fig. 5 și Tabelul 3, 5-10% pozitivitate), în timp ce 6% dintre adenoame și 57% dintre carcinoame au prezentat o colorare puternică a p53 (Fig. 5 și Tabelul 3, >10% pozitivitate, P < 0,0001). Majoritatea tumorilor cu colorare puternică a p53 au prezentat p53 LOH, în timp ce tumorile cu colorare slabă a p53 au păstrat încă alela de tip sălbatic Trp53 (Fig. 6). Rezultatele noastre sunt similare cu cele observate în lucrările recente privind expresia proteinei p53 missense în sarcoamele de șoarece și în carcinomul mamar . Datele noastre demonstrează că, asemănător cu situația din tumorigeneza colonului uman , expresia unei proteine p53 mutante missense stabilizate este strâns corelată cu pierderea funcției p53 de tip sălbatic și cu progresia spre invazie.

Stabilizarea proteinei mutante p53R270H în timpul progresiei tumorale de la hiperplazie la carcinom la șoarecii AKP270/+. Colorația imunohistochimică a p53 într-un polip hiperplastic reprezentativ (HP, b, panoul din stânga), un adenom (b, panoul din dreapta) și trei carcinoame (c) apărute în cecum la șoarecii AKP270/+. O secțiune din cecum de la un șoarece de tip sălbatic a fost utilizată ca martor (a). Colorarea p53 variază de la o colorare nedetectabilă în secțiunile normale (a) și HP (b), la o colorare slabă (<10% pozitivitate) în adenom (b) și carcinomul 1(c, panoul din stânga), și la o colorare puternică în carcinoamele 2 și 3 (>10% pozitivitate). Liniile punctate indică muscularis mucosae. Săgețile negre indică glandele invazive cu colorare slabă a p53; săgețile roșii indică glandele invazive cu colorare puternică a p53. Barele de scară: 50 μm

Stabilizarea mutantului missense p53R270H este corelată cu pierderea de heterozigozitate (LOH) a p53. a Genotiparea tumorilor de colon (T2-T6) apărute la șoarecii AKP270/+ la 5 luni după inducerea TAM. O tumoare apărută la un șoarece AKP270/fl (T1) și un țesut de colon de la un șoarece de tip sălbatic (N) sunt utilizate ca martor pozitiv și, respectiv, negativ. Prezența alelei Trp53 de tip sălbatic și a alelei mutante Trp53 recombinate (flox out) au fost detectate prin PCR. b-e Colorarea imunohistochimică a p53 în țesuturile de colon descrise în (a) arată o corelație puternică între stabilizarea p53 mutant (d, T2 și T3) și pierderea de heterozigozitate p53, în comparație cu colorarea slabă a p53 și prezența alelei Trp53 de tip sălbatic în tumorile 4-6 (e). Liniile punctate indică musculatura mucoasei. Barele de scară: 100 μm

Profilarea globală a expresiei genice relevă puține diferențe între celulele tumorale de colon de la șoareci sau de la om care adăpostesc mutația R270H/R273H missense și alelele Trp53/TP53 nul

Am profilat expresia genică în țesuturile de adenocarcinom de colon de la șoareci AKP270/fl (n = 6) sau AKPfl/fl (n = 6), utilizând Affymetrix Mouse ST 2.1 Arrays cu 24 562 de seturi de sonde. Am izolat ARN în urma microdisecției prin capturare cu laser (LCM) a celulelor canceroase dintr-o tumoare primară invazivă de la fiecare șoarece. Ca martori, au fost incluse celule epiteliale normale de colon microdisecate de la șoareci de tip sălbatic (n = 3). Am ajustat modele ANOVA la aceste 15 probe cu termeni pentru 3 medii. Comparațiile țesuturilor tumorale cu țesuturile normale au dat peste 2.400 de seturi de sonde cu P < 0,001 atât pentru tumorile AKP270/fl, cât și pentru tumorile AKPfl/fl, dar compararea celor două tipuri de tumori între ele a dat doar 30 de seturi de sonde, în condițiile în care ne așteptăm la 24,6 seturi de sonde (24.562*0,001) doar din întâmplare. Acest din urmă rezultat indică faptul că cele mai multe dintre cele 30 de seturi de sonde găsite sunt fals pozitive (tabelul 4, porțiunea de sus) și că au existat puține sau chiar deloc diferențe semnificative observabile în expresia genelor între tumorile de colon cu mutații Trp53 missense și cele cu mutații Trp53 null. În concordanță cu această noțiune, am constatat că adenocarcinoamele AKP270/fl și AKPfl/fl nu se puteau distinge în analizele componentelor principale (PC) ale expresiei genice, deși ambele grupuri de tumori au modele de expresie genică care sunt clar distincte de epiteliul de colon de tip sălbatic (Fig. Suplimentară. 5).

Am efectuat, de asemenea, analiza expresiei genice Affymetrix pe organoizi derivați din tumorile de colon apărute la șoarecii AKP270/fl (n = 3) sau la șoarecii AKPfl/fl (n = 2). Organoidele derivate din adenoame la șoarecii Apcfl/fl (Cont 1, n = 3) sau din epiteliul de colon de tip sălbatic (Cont 2, n = 4) au fost utilizate ca martori. Am ajustat un model ANOVA la cele patru grupuri de organoizi. Am găsit 435 de seturi de sonde cu P < 0,001 pentru organoidele AKPfl/fl și 609 seturi de sonde pentru organoidele AKP270/fl, în comparație cu organoidele Apc-null (Cont 1, Tabelul 4). În plus, au fost identificate mai multe seturi de sonde exprimate diferențiat (960 pentru AKPfl/fl și 1332 pentru AKP270/fl, P < 0,001) atunci când organoidele AKPfl/fl sau AKP270/fl au fost comparate cu organoidele de colon normale (Cont 2, Tabelul 4). Am efectuat un test de îmbogățire a căilor de acces pe genele care au fost exprimate diferențiat atât în tumorile și organoidele AKPfl/fl, cât și în AKP270/fl, comparativ cu epiteliul de colon normal. Am constatat că o varietate de căi au fost modificate în mod semnificativ atât în celulele derivate din tumori cu p53 nul, cât și în cele cu mutație de missense, genele implicate în punctul de control G2M, creșterea celulară, răspunsul la stres și metabolismul celular fiind cele mai semnificativ modificate seturi de gene (Tabelul suplimentar 2). Cu toate acestea, am obținut doar 35 de seturi de sonde cu P < 0,001 pentru comparația AKPfl/fl vs. AKP270/fl (tabelul 4), unde, din nou, 24,6 au fost așteptate din întâmplare, ceea ce arată că a fost dificil să găsim diferențe de expresie genetică între organoidele cu mutații Trp53 nul și missense. Graficele PC au arătat că eșantioanele AKPfl/fl și AKP270/fl s-au grupat întotdeauna împreună și au fost separate de organoidele derivate din adenoame mutante Apc (Cont1, Fig. 6 suplimentară) sau din epiteliul normal al colonului (Cont2, Fig. 6 suplimentară).

Pentru a testa dacă au existat diferențe demonstrabile în modelele de expresie a genelor între CCR umane cu mutații missense și cu mutații TP53 nule, am analizat numărătorile normalizate transformate în log2 din datele RNA-seq pentru CCR din The Cancer Genome Atlas (TCGA) , comparând 9 tumori cu mutații TP53 codon 273 missense cu 36 de tumori cu mutații nule (cauzate de mutații frame shift, splice site și nonsense, a se vedea tabelul suplimentar 3 pentru detalii) prin testul T cu două eșantioane pentru 20531 gene. Am găsit doar 244 de gene cu P < 0,01 și 30 de gene cu P < 0,001, care au fost doar puțin mai multe decât numărul așteptat prin hazard (205 și, respectiv, 20,5, Tabelul 4). TP53 însuși a dat cea mai semnificativă diferență în expresia genelor, fiind de aproape 5 ori mai mică în medie în tumorile cu mutații nule față de mutațiile TP53 codon 273 (Tabelul suplimentar 4, P = 2 × 10-10). Din nou, am constatat o mică separare a celor două seturi de tumori în analiza PC (Fig. Suplimentară 7). În concordanță cu semnătura transcripțională similară, am ajustat modelele de hazard proporționale Cox la 43 de pacienți cu date de supraviețuire, utilizând vârsta, stadiul și statutul TP53 în model, și nu am găsit nicio asociere semnificativă între rezultatul pacientului și statutul mutației TP53 (mutație cu misens R273 vs. mutație nulă, Tabelul suplimentar 5, P = 0,67 prin testul Wald). Este demn de menționat faptul că, cu doar 7 decese în rândul acestor pacienți, puterea de detectare a diferențelor a fost destul de scăzută. În cele din urmă, am analizat intersecția genelor care au dat P < 0,05 în oricare dintre cele trei seturi de date descrise mai sus (și anume, tumori de colon umane și de șoarece, organoizi de colon de șoarece) care s-au schimbat în aceeași direcție pentru comparația Trp53/TP53 missense vs. nulă. În tabelul suplimentar 4 prezentăm genele care au dat P < 0,05 și fold-changes de cel puțin 1,3 în oricare două dintre cele trei seturi de date. Am găsit doar Trp53/TP53 care s-a schimbat în aceeași direcție în toate cele trei studii (Tabelul suplimentar 4; statisticile detaliate pentru fiecare genă în toate cele trei seturi de date sunt disponibile în seria noastră publică GEO). Luate împreună, analizele noastre de expresie genică pentru CCR de șoareci și umane indică faptul că tumorile de colon cu mutații R270/R273 missense sau cu mutații Trp53/TP53 nule au profiluri de expresie genică foarte asemănătoare, ceea ce este în concordanță cu absența oricăror diferențe majore în ceea ce privește caracteristicile biologice în tumorile de colon și fenotipurile care apar in vivo la șoarecii AKP270/fl și AKPfl/fl.

.