Test oksydacyjno-fermentacyjny (OF) został opracowany przez Hugh i Leifsona w 1953 roku. Opracowali oni podłoża OF w celu rozróżnienia pomiędzy bakteriami oksydacyjnymi (które produkują kwas z węglowodanów tylko w warunkach tlenowych) i bakteriami fermentacyjnymi (które produkują kwas zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych).
Mikroorganizmy sacharolityczne rozkładają glukozę albo fermentacyjnie albo oksydacyjnie. Produktami końcowymi fermentacji są stosunkowo silne kwasy mieszane, które można wykryć w konwencjonalnym podłożu do badań fermentacyjnych. Jednakże, kwasy powstające podczas oksydacyjnej degradacji glukozy są wyjątkowo słabe i mniej liczne, a do ich wykrycia wymagana jest bardziej czuła pożywka do fermentacji oksydacyjnej Hugh i Leifsona OF. Pożywka ta została sporządzona przez zwiększenie ilości glukozy powyżej tej, która występuje w pożywce używanej do wykrywania fermentacji i przez zmniejszenie ilości peptonu.
Pożywka OF Hugha i Leifsona różni się od pożywki do fermentacji węglowodanowej w następujący sposób:
- Stężenie agaru jest zmniejszone do 2% z 3%, dzięki czemu ma półstałą konsystencję (pomaga to w określeniu ruchliwości organizmu).
- Stężenie peptonu jest zmniejszone z 11% do 2%. (Zmniejszenie ilości alkalicznego produktu wytwarzanego przez metabolizm peptonu; zmniejszając w ten sposób neutralizujące działanie tych produktów).
- Stężenie węglowodanów jest zwiększone o 0,5% do 1.0% (Zwiększone stężenie glukozy w pożywce zwiększa produkcję tych słabych kwasów do poziomu, który może być wykryty przez wskaźnik błękitu bromtymolowego.)
Zasada:
Test oksydacyjno-fermentacyjny określa, czy pewne prątki gram-ujemne metabolizują glukozę przez fermentację lub oddychanie tlenowe (oksydacyjnie). Podczas beztlenowego procesu fermentacji, pirogronian jest przekształcany do różnych kwasów mieszanych w zależności od rodzaju fermentacji. Wysokie stężenie kwasu wytworzonego podczas fermentacji zmieni wskaźnik błękitu bromotymolowego w podłożu OF z zielonego na żółty w obecności lub przy braku tlenu .
Niektóre niefermentujące bakterie gram-ujemne metabolizują glukozę przy użyciu oddychania tlenowego i dlatego wytwarzają tylko niewielką ilość słabych kwasów podczas glikolizy i cyklu Krebsa. Zmniejszenie ilości peptonu i zwiększenie ilości glukozy ułatwia wykrycie tak wytworzonych słabych kwasów. Bufor fosforanu dipotasu jest dodawany w celu dalszego ułatwienia wykrywania kwasów.
Zastosowanie:
OF Test jest używany do określenia, czy bakterie gram-ujemne metabolizują węglowodany oksydacyjnie, przez fermentację, czy są nonsachrolityczne (nie mają zdolności do wykorzystania węglowodanów w podłożu).
Podłoże:
Podłoże podstawowe OF firmy Hugh i Leifson; składniki są następujące:
- Chlorek sodu : 5.0 g
- Fosforan dwu-potasowy : 0.3 g
- Pepton : 2.0 g
- Błękit bromtymolowy:0.03 g
- Agar: 3.0 g
- Glukoza : 10 g
- Woda : 1000 ml
Przed autoklawowaniem pH powinno być dostosowane do 7.1. Po autoklawowaniu pożywki w temperaturze 121°C przez 15 minut, do pożywki dodaje się aseptycznie wysterylizowany przez filtr roztwór 10% roztworu węglowodanów do końcowego stężenia 1%.
Postępowanie
- Zakażać dwie probówki z pożywką testową OF organizmem badanym za pomocą prostego drutu, nakłuwając „w połowie drogi do dna” probówki.
- Pokryć jedną probówkę z każdej pary 1 cm warstwą sterylnego oleju mineralnego lub ciekłej parafiny (stwarza to warunki beztlenowe w probówce poprzez uniemożliwienie dyfuzji tlenu), pozostawiając drugą probówkę otwartą na powietrze.
- Inkubować obie probówki w temperaturze 35°C przez 48 godzin (wolno rosnące bakterie mogą potrzebować 3 do 4 dni zanim będzie można zaobserwować wyniki)
Interpretacja
Wytwarzanie kwasu jest wykrywane w pożywce przez pojawienie się żółtego koloru. W przypadku organizmów utleniających; wytwarzanie koloru może być najpierw zauważone w pobliżu powierzchni pożywki.
Poniżej przedstawiono schematy reakcji:
- Wynik fermentacji: Wytwarzanie kwasu w obu probówkach (otwartej i zakrytej). Wytworzony kwas zmienia wskaźnik pH, błękit bromtymolowy, z zielonego na żółty. np. Escherichia coli
- Wynik utleniający: Wytwarzanie kwasu w otwartej probówce (aerobowej), a nie w probówce pokrytej olejem (anaerobowej) wskazuje na wynik oksydacyjny. Bakterie niefermentujące, które metabolizują glukozę poprzez metabolizm oksydacyjny, dają wynik oksydacyjny. np. Pseudomonas aeruginosa
- Niesacharolityczne (wynik ujemny OF): Bakterie niesacharolityczne dają ujemny wynik OF. Na wynik ujemny wskazuje brak zmiany koloru w probówce pokrytej olejem, a w niektórych przypadkach wzrost pH (pH 7.6) zmieniający kolor błękitu bromtymolowego z zielonego na niebieski w górnej części otwartej probówki. Wzrost pH jest spowodowany produkcją amin przez bakterie, które rozkładają pepton (białko) w pożywce.
np. Alcaligenes faecalis.
Kontrola jakości
- Fermentator glukozy: Escherichia coli
- Oksydator glukozy: Pseudomonas aeruginosa
- Niesacharolityczny: Moraxella species
.
Dodaj komentarz