Rapid lateral flow immunoassay for the fluorescence detection of SARS-CoV-2 RNA

W systemie HC-FIA, FNPs sfunkcjonalizowane DNA sondy wzmacniają sygnał hybrydyzacji wirusowego RNA i DNA w sondzie. Zasada konstrukcji biosensora HC-FIA jest przedstawiona na Rys. 1.

a, Zasada działania HC-FIA. b, Reprezentatywne wyniki na pasku bocznego przepływu. c, Urządzenie do analizy fluorescencyjnej. d, Zdjęcie przenośnego laboratorium walizkowego o długości 55,5 cm, szerokości 37 cm i wysokości 23 cm, o wadze 8,5 kg. e, Proces badawczy testu HC-FIA. Etap 1: hybrydyzacja kwasów nukleinowych w inkubatorze w stałej temperaturze. Krok 2: oznaczanie intensywności sygnałów fluorescencyjnych na karcie testowej przy użyciu urządzenia przedstawionego w punkcie c. f, Rozmieszczenie sond w genomie SARS-CoV-2.

Projekt i działanie testu HC-FIA

Mordercze S9.6 są prefiksowane na linii testowej (T) paska przepływu bocznego, a linia kontrolna (C) jest pokryta poliklonalnymi przeciwciałami kozimi anty-rabbit IgG (Rys. 1a). FNP znakowane przeciwciałami S9.6 i króliczą IgG umieszczane są w probówce reakcyjnej. Na początku procesu wykrywania, SARS-CoV-2 w próbce wymazu z gardła lub plwociny jest lizowany i uwalniany, a uwolnione RNA hybrydyzuje ze specyficzną sondą DNA SARS-CoV-2. Powstała hybryda RNA-DNA jest wychwytywana przez przeciwciała S9.6 znakowane FNP, a kompleks przepływa wzdłuż podkładki z próbkami i membrany nitrocelulozowej w kierunku papieru absorpcyjnego pod wpływem sił kapilarnych. Podczas przechodzenia przez obszar T, kompleks jest wychwytywany przez przeciwciała S9.6, stopniowo generując sygnał fluorescencyjny. W obszarze C, królicza IgG znakowana FNP jest wychwytywana przez przeciwciała IgG królika. Obecność lub brak docelowego RNA SARS-CoV-2 opiera się na wartości odcięcia dla intensywności fluorescencji (rys. 1b,c). Rysunek 1d przedstawia przenośne laboratorium walizkowe, które jest w stanie dostarczyć wyniki jakościowe w czasie krótszym niż godzina po wykonaniu następujących dwóch kroków: hybrydyzacji i analizy immunofluorescencyjnej (Rys. 1e).

Użyliśmy tutaj stosunku sygnału fluorescencji testowej do sygnału fluorescencji kontrolnej (T/C) na pasku przepływu bocznego, tak aby zminimalizować wpływ jakiejkolwiek fluorescencji tła karty testowej. Mierząc stosunek T/C próbek wymazu z gardła od 211 zdrowych osób, stwierdziliśmy, że średni stosunek T/C tła wynosił 49,95, ze średnią wartością s.d. wynoszącą 17,16 (ryc. 1a). Krzywa ROC (receiver operating characteristic) i pole pod krzywą (area under the curve, AUC) zostały użyte do określenia wartości odcięcia i oceny dokładności diagnostycznej testu HC-FIA na podstawie czułości i swoistości przy różnych wartościach progowych. Wyznaczyliśmy krzywą ROC z AUC równą 0,999 z 95% przedziałem ufności (CI) 0,997-1,000 (Ryc. 1b), używając próbek wymazu z gardła od 100 klinicznie potwierdzonych i wykluczonych przypadków COVID-19. Wartość odcięcia, która uzyskała najwyższą czułość i swoistość, została określona na 102,07, co odpowiada punktowi indeksu Youdena wynoszącemu 0,980. Alternatywnie, wartość progowa równa dwukrotnej wartości tła ujemnego (tutaj 49,95 × 2 = 99,90) jest zwykle używana jako wartość odcięcia w testach immunologicznych. Dla wygody wybraliśmy wartość odcięcia T/C równą 100,00.

Rozwój testuHC-FIA

Optymalizacja sond DNA dla docelowej sekwencji RNA wirusa SARS-CoV-2 jest kluczem do poprawy wydajności testu. Lista wszystkich zaprojektowanych przez nas sekwencji sond DNA znajduje się w Tabeli Dodatkowej 1. Genom SARS-CoV-2 składa się z około 30 000 zasad, w tym zmiennej liczby (6-11) otwartych ramek odczytu (ORF). Pierwszy ORF stanowi około 67% całego genomu i koduje 16 białek niestrukturalnych, a także białka pomocnicze i strukturalne. Cztery główne białka strukturalne to glikoproteina kolców (S), małe białko otoczki (E), białko macierzy (M) i białko nukleokapsydu (N)15,16. Większość testów wykrywających kwas nukleinowy dla SARS-CoV-2 wykorzystuje następujące trzy konserwatywne regiony w genomie wirusa: ORF1ab, w którym zlokalizowany jest gen polimerazy zależnej od RNA (rdrp)15, oraz regiony kodujące N i E.

Zaczęliśmy od pobrania sekwencji genomu RNA wirusa SARS-CoV-2 z National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (numery akcesyjne, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 i NC_045512.1). Szczegółowa analiza innych opublikowanych sekwencji genomu SARS-CoV-2 nie wykazała żadnych istotnych różnic w tych regionach. Przy pomocy oprogramowania Primer Premier 5.0 zaprojektowaliśmy po trzy sondy dla każdego z trzech regionów: CoV01 i CoV04, zlokalizowane w regionie zalecanym do wykrywania ORF1ab i N, odpowiednio; oraz CoV08, w tym samym regionie co E17. Pozycje genomowe miejsc wiązania sond w sekwencji genomu referencyjnego (NC_045512.2) są wskazane na Rys. 1f.

Zrównanie sekwencji przeprowadzono pomiędzy zaprojektowanymi sondami DNA a sekwencjami z genomu człowieka oraz genomów wirusów, bakterii, mykoplazmy, chlamydii i innych powszechnie występujących patogenów. Sondy pasowały jedynie do sekwencji genomowej SARS-CoV-2, nie stwierdzono homologii z ludzkim genomowym DNA. Pseudowirusy niosące różne regiony genu docelowego, skonstruowane przy użyciu lentiwirusów jako wektorów, zostały użyte jako kontrole pozytywne. Sekwencje genów docelowych użytych pseudowirusów są przedstawione w Tabeli Dodatkowej 2. P1 był pozytywny dla regionu N SARS-CoV-2, P2 dla regionu E SARS-CoV-2, a P3 dla regionu ORF1ab SARS-CoV-2. Stężenie trzech kontroli pozytywnych wynosiło 3 000 jednostek transdukcyjnych (TU) ml-1, co wskazuje na obecność 3 000 zakaźnych cząstek wirusa w 1 ml. Jako kontrole ujemne N1-N17 zastosowano sól fizjologiczną, wodę oczyszczoną i próbki wymazu z gardła pozytywne dla innych powszechnych patogenów. Lista informacji o pozytywnych i negatywnych referencjach użytych w badaniu jest przedstawiona w Tabeli Uzupełniającej 3. Wyniki badań przedstawiono w tabelach uzupełniających 4-6. Dla regionu ORF1ab wybrano sondy CoV01 i CoV03, dla regionu E wybrano sondę CoV08, a dla regionu N sondy CoV04 i CoV06 preferencyjnie wiązały się z docelowym RNA. Wybrane sondy DNA były dalej optymalizowane przez połączenie (Tabela uzupełniająca 7), z każdą grupą sond jednocześnie skierowanych na wszystkie trzy segmenty. Wyniki testu HC-FIA w tabeli uzupełniającej 8 pokazują, że połączenie sond Cov01, Cov04 i Cov08 (grupa 2) rozróżniało wszystkie pozytywne próbki kontrolne i kontrole negatywne oraz wykrywało pozytywne próbki z niskim mianem wirusa (1,000 TU ml-1; tabela uzupełniająca 3, L1-L3) przy wskaźniku pozytywnym wyższym niż 95%. Grupa 2 została zatem wybrana jako ostateczna kombinacja. Do chwili obecnej w NCBI opublikowano 13 411 sekwencji nukleotydów SARS-CoV-2. Wyrównanie trzech sond z odpowiadającymi im regionami docelowymi w 13,411 przesłanych sekwencjach ujawniło, że regiony docelowe sond były wystarczająco konserwowane, aby uzyskać 100% podobieństwo.

Zoptymalizowaliśmy również warunki badania, w szczególności czas inkubacji do hybrydyzacji i czas odczytu paska testowego. Wydajność testu dla czasów inkubacji 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min i 60 min w temperaturze 56 °C jest pokazana w Tabeli 9. Należy zauważyć, że 20 min było wystarczające do hybrydyzacji sond DNA z regionem docelowym, co zostało odzwierciedlone w 100% pozytywnym wskaźniku w wykrywaniu pozytywnych próbek wymazu z gardła i plwociny z niskim mianem wirusa (1,000 TU ml-1; Tabela Uzupełniająca 3, L1-L3). Kiedy czas inkubacji został wydłużony do 50 lub 60 min, reakcja nie była tak stabilna, ponieważ odsetek pozytywnych próbek referencyjnych L1-L3 zmniejszył się. Biorąc pod uwagę skuteczność detekcji i wymóg inaktywacji wirusa, wybraliśmy 30 min jako czas inkubacji do hybrydyzacji w 56 °C. Oceniliśmy również czas odczytu paska dla wartości 10 min, 12 min, 15 min i 18 min (Tabela uzupełniająca 10). Wyniki wskazywały, że 12 min lub dłużej prowadziło do prawidłowej detekcji pozytywnych i negatywnych próbek referencyjnych. Jednakże współczynnik zmienności (CV) był niższy niż 10% dla wykrywania pozytywnych próbek z niskim mianem wirusa tylko przy zastosowaniu czasu odczytu 15 min. Dlatego wybraliśmy czas odczytu 15 min.

Tiocyjanian guanidyny i chlorek guanidyny – najczęściej używane środki denaturujące białka do ekstrakcji kwasów nukleinowych – zostały porównane jako media transportowe do konserwacji próbek. Tiocyjanian guanidyny prowadził do lepszej wydajności w rozróżnianiu pomiędzy próbkami pozytywnymi i negatywnymi, z relatywnie niskim CV dla próbek z niskim mianem wirusa. W rzeczywistości, tiocyjanian guanidyny w stężeniu tak wysokim jak 6 mol l-1 wykazał doskonałe właściwości przeciwwirusowe18. Wybraliśmy tiocyjanian guanidyny w stężeniu 5 mol l-1 jako denaturat białkowy do inaktywacji wirusa w medium transportowym.

Swoistość testu HC-FIA

Po zoptymalizowaniu sekwencji sond i warunków reakcji, zbadaliśmy swoistość testu HC-FIA do wykrywania SARS-CoV-2. Kontrole pozytywne obejmowały pseudowirusy (próbki P1-P3) z docelowymi genami i pięć klinicznych próbek wymazu z gardła (próbki P4-P8), potwierdzonych przy użyciu zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych opartego na RT-qPCR (Shanghai ZJ Bio-Tech). Kontrole negatywne, które składały się z próbek wymazu z gardła, zostały potwierdzone jako negatywne dla SARS-CoV-2, a pozytywne dla grypy A, grypy B, wirusa syncytialnego układu oddechowego, chlamydii pneumoniae, adenowirusa lub innych patogenów (próbki N5-N17), lub pseudowirusów pozytywnych dla regionu N MERS (próbka N18) lub SARS (próbka N19). Lista wszystkich próbek jest przedstawiona w Tabeli Uzupełniającej 3. Lista wyników wykrywania 8 pozytywnych próbek referencyjnych i 15 negatywnych próbek referencyjnych jest przedstawiona w Tabeli uzupełniającej 11.

Badaliśmy, czy istniała reaktywność krzyżowa między SARS-CoV-2 a 55 powszechnymi patogenami, które powodują choroby układu oddechowego. Źródło i informacje ilościowe każdego mikroorganizmu patogennego podano w Supplementary Dataset 1. Pierwotne miano wirusa określono na 106 jednostek tworzących płytki na ml przy użyciu testu płytkowego. Dla próbek interferencyjnych bakterii, mykoplazmy i chlamydii poziom stężenia wynosił 107 jednostek tworzących kolonie na ml. Ponadto, ludzki genomowy DNA został wyekstrahowany i oznaczony ilościowo na 90-105 µg ml-1 z trzech próbek krwi pełnej. Test HC-FIA wykazywał doskonałą swoistość dla SARS-CoV-2, bez oczywistej reaktywności krzyżowej z wszystkimi innymi próbkami patogenów i ludzkim genomowym DNA (Supplementary Dataset 1).

Jako że przeciwciało monoklonalne S9.6 wiąże się również z dupleksami RNA-RNA19, zwłaszcza bogatymi w AU20, zaprojektowaliśmy dwuniciowe sekwencje RNA o różnych frakcjach AU. Szczegółowe informacje o sekwencjach są podane w Tabeli uzupełniającej 12. Jak pokazano w Tabeli Dodatkowej 13, niezależnie od zawartości AU, test HC-FIA nie wykazywał wykrywalnego pozytywnego sygnału w kierunku dwuniciowego RNA, co wskazuje na niskie powinowactwo wiązania między przeciwciałem S9.6 a dwuniciowym RNA w warunkach testu. Zbadaliśmy również, czy obecność dwuniciowego RNA wpływa na wydajność testu w wykrywaniu próbek klinicznego wymazu z gardła lub plwociny. Użyliśmy 2 pozytywnych próbek wymazu z gardła, 2 pozytywnych próbek plwociny, 10 negatywnych próbek wymazu z gardła i 5 negatywnych próbek plwociny. Zmierzyliśmy współczynniki T/C w odniesieniu do wartości T/C testu wolnego od interferencji i stwierdziliśmy, że współczynniki wahały się od 0,9 do 1,1 (Supplementary Dataset 1). Wskazuje to, że obecność dwuniciowego RNA, niezależnie od zawartości AU, nie wpływa znacząco na wydajność testu HC-FIA.

Czułość i precyzja testu HC-FIA

Seryjnie rozcieńczaliśmy próbki pseudowirusów zawierające trzy odcinki genów docelowych do mian 5 000, 2 500, 1 000, 800, 500, 250 i 100 TU ml-1 i obliczaliśmy średnie wartości T/C dla 20 równoległych testów. Rysunek 2a pokazuje, że wartości granicy wykrywalności (LOD) pseudowirusa pozytywnego dla regionów N, E lub ORF1ab SARS-CoV-2 były tak niskie, jak 1,000 TU ml-1, ze wskaźnikiem pozytywnym większym niż 95%. Kiedy miano próbek pseudowirusów osiągnęło 108 TU ml-1, nie zaobserwowano zauważalnego efektu „haczyka” (Ryc. 2 uzupełniająca). Zakres liniowy oznaczenia odpowiada mianom pomiędzy 103 a 106 lub 107 TU ml-1.

Osie pionowe pokazują stosunek fluorescencji do intensywności (T/C) sygnału testowego (T) i sygnału kontrolnego (C). Dla każdego stężenia przeprowadzono równolegle 20 testów. LOD określono jako stężenie, przy którym odsetek wyników pozytywnych był większy lub równy 95%. a, Stosunki T/C dla seryjnie rozcieńczonych próbek pseudowirusów pozytywnych dla regionów N, E i ORF1ab wirusa SARS-CoV-2. b, Stosunki T/C dla seryjnie rozcieńczonych próbek wymazu z gardła od trzech krytycznie chorych pacjentów. Dane są średnią ± s.d.

Próbki wymazu z gardła od trzech krytycznie chorych pacjentów – u których stwierdzono dodatni wynik na obecność SARS-CoV-2 przy użyciu RT-qPCR, a ładunki wirusów określono ilościowo przy użyciu cyfrowej PCR – zmieszano z ujemnymi próbkami wymazu z gardła w celu przygotowania seryjnych rozcieńczeń 2000, 1000, 500, 400 i 250 kopii na ml. Jak pokazano na Rys. 2b, LOD wynosiła 500 kopii na ml, a odsetek wyników dodatnich przekraczał 95%. Kliniczne próbki wymazu z gardła z wartościami T/C zbliżonymi do wartości krytycznej (100) dla wyniku pozytywnego (próbki z 512, 489 i 497 kopiami na ml regionu ORF1ab, zgodnie z cyfrowym PCR) zostały użyte do weryfikacji LOD (testy wykonane 20 razy równolegle). Odsetek pozytywnych wyników dla tych próbek był wyższy niż 95% (Tabele uzupełniające 14-16).

Aby ocenić precyzję zestawu HC-FIA, wykonano równoległe testy 20 razy dla każdej próbki klinicznego wymazu z gardła przez pięć kolejnych dni. Wybrano reprezentatywne próbki kliniczne: próbkę dodatnią (1,348 kopii na ml regionu ORF1ab), próbkę od osoby krytycznie chorej (krytyczna; 512 kopii na ml) i próbkę ujemną (0 kopii na ml). Średnie wartości T/C trzech partii w wykrywaniu próbki dodatniej były następujące: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) i 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), odpowiednio, w porównaniu z 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) i 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) dla próbki krytycznej oraz z 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) i 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66%) dla próbki negatywnej. Wartości CV między partiami wynosiły 3,89%, 4,66% i 6,74%. Tak więc, badanie wykazało dobrą precyzję i odtwarzalność do wykrywania SARS-CoV-2.

Solidność badania HC-FIA

Aby poznać solidność badania HC-FIA, oceniliśmy wpływ endogennych substancji zakłócających (takich jak hemoglobina i mucyna) oraz egzogennych substancji zakłócających (w szczególności leków klinicznych powszechnie stosowanych w leczeniu pacjentów z infekcjami układu oddechowego, w tym leków przeciwwirusowych, antybiotyków i hormonów). Do eksperymentu wykorzystano 18 próbek klinicznych wymazów z gardła, w tym sześć próbek krytycznych (500-530 kopii na ml dla regionu ORF1ab, zgodnie z cyfrowym PCR), sześć próbek negatywnych i sześć próbek pozytywnych. Wyniki były również zapisywane jako stosunek wartości T/C (próbki interferencyjne versus próbki kontrolne). W przygotowanych próbkach interferencyjnych stężenia hemoglobiny wynosiły 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 i 2,0 g l-1, a stężenia dla mucyny wynosiły 5 g l-1, 10 g l-1 i 20 g l-1. Stężenia leków w egzogennych próbkach interferencyjnych (tabele uzupełniające 17-19) były znacznie wyższe niż ich szczytowe stężenia w osoczu in vivo. Jak oczekiwano, wszystkie współczynniki T/C mieściły się w zakresie 0,9-1,1 (Supplementary Dataset 2), wskazując, że badanie HC-FIA jest odporne na zakłócenia.

Kliniczna ocena zestawu testowego HC-FIA

Aby dokładniej ocenić wydajność testu HC-FIA, przeprowadzono randomizowane badanie kliniczne z podwójnie ślepą próbą, porównując test z RT-qPCR (zestaw do wykrywania SARS-CoV-2 wyprodukowany przez Shanghai ZJ Bio-Tech i zatwierdzony przez NMPA) lub z wynikami diagnostyki klinicznej w trzech niezależnych instytucjach medycznych. Zestaw testowy HC-FIA używany w ocenie klinicznej zawierał karty testowe, bufor do lizy, roztwór do konserwacji próbek, kontrole dodatnie i ujemne oraz probówkę reakcyjną z sondami DNA i znakowanymi przeciwciałami. Wyniki diagnostyki klinicznej potwierdzonych lub wykluczonych przypadków COVID-19, które zostały dostarczone przez wyznaczone szpitale, były oparte na obrazach tomografii komputerowej i na objawach klinicznych pacjentów, zgodnie z wytycznymi „Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial Version 6.0)” Chin. Łącznie przebadano równolegle 734 próbki (593 wymazy z gardła i 141 plwociny) dostarczone przez 670 osób. Surowe dane z badań klinicznych są dostarczone jako Supplementary Dataset 3. Zestaw do wykrywania RT-qPCR, którego użyliśmy, został zaprojektowany jako system trójcelowy (ORF, N i E), a my postępowaliśmy zgodnie z zasadą test-retest w celu rozróżnienia między pozytywnymi i negatywnymi próbkami. Oprócz czterech nieudanych testów spowodowanych nieprawidłowym standardem wewnętrznym, przeprowadzono osiem ponownych testów: jeden, ponieważ tylko jeden docelowy gen rdrp był pozytywny, a siedem, ponieważ tylko geny N i E były pozytywne. W tych przypadkach poprzednie negatywne wyniki zostały wykluczone.

Spośród 670 pacjentów włączonych do badania, 313 było mężczyznami (46,72%), a 357 było kobietami (53,28%). Jak pokazano na rycinie uzupełniającej 3, rozkład wieku zapisanej populacji jest podobny do rozkładu wieku zakażenia SARS-CoV-221. Wskaźnik odwiedzin i wskaźnik rozpoznania były również zrównoważone. Wyniki z zestawów testowych HC-FIA przedstawiono na ryc. 3, na którym pokazano zdjęcia typowych wyników w świetle fluorescencyjnym i odpowiadającą im gradientową matrycę kolorów po normalizacji odczytu. Gradientowa matryca kolorów na Dodatkowym Rys. 4 przedstawia znormalizowane odczyty fluorescencji 734 próbek klinicznych (Supplementary Dataset 3).

Zdjęcia typowych wyników pod fluorescencyjnym źródłem światła i odpowiadające im odczyty fluorescencji jako matryca gradientu kolorów, znormalizowane do maksymalnej wartości odczytu. Grupa E składa się wyłącznie z wyników COVID-19-negatywnych. Linia pozioma na pasku koloru wskazuje wartość odcięcia. Macierz gradientu kolorów dla odczytów fluorescencji 734 próbek klinicznych jest przedstawiona na dodatkowym rycinie 4, a odpowiednie dane liczbowe w Supplementary Dataset 3.

Dla 621 przypadków wyniki HC-FIA i diagnozy kliniczne były zgodne (210 potwierdzonych przypadków i 411 wykluczonych przypadków; Tabela 1); 49 przypadków (27 potwierdzonych i 22 wykluczone przez diagnozę kliniczną) było niezgodnych z wynikami HC-FIA. W przypadku 730 próbek wyniki testu HC-FIA były zgodne z RT-qPCR (249 pozytywnych i 481 negatywnych; Tabela 1). Cztery próbki, które były negatywne na podstawie RT-qPCR, były pozytywne przy użyciu HC-FIA. Trzy z tych próbek pochodziły od pacjentów, którzy zostali klinicznie zdiagnozowani jako wykluczeni z COVID-19, wskazując, że test HC-FIA dał wyniki fałszywie dodatnie. Pozostała próbka odpowiadała potwierdzonemu przypadkowi na podstawie diagnozy klinicznej, co jest zgodne z testem HC-FIA.

Kappa Cohena (κ), która jest często używaną miarą wiarygodności porozumienia między zmiennymi kategorycznymi, jest bardziej solidną miarą w porównaniu z prostym procentowym porozumieniem między zmiennymi, ponieważ κ uwzględnia porozumienia, które występują przypadkowo, szczególnie w niezrównoważonych zestawach danych. Uznaliśmy, że wartość κ większa niż 0,75 wskazuje na wysoki poziom zgodności (doskonała zgodność odpowiada κ = 1). Jak pokazano w Tabeli 2, wyniki testu HC-FIA były w wysokiej zgodności z diagnozą kliniczną (κ = 0,8393) i z RT-qPCR (κ > 0,98, niezależnie od typu próbki).

.