Radiometryczne testy wiązania ligandów | Application Support Knowledgebase | Lab Products & Services | PerkinElmer

top

Overview

Radioaktywne ligandy są powszechnie stosowane do pomiaru wiązania ligandów do receptorów. W tym teście, będziesz mierzył wiązanie ligandu znakowanego radioaktywnie do komórek lub błon komórkowych zawierających interesujący Cię receptor. Zarówno całe komórki jak i błony komórkowe mogą być użyte do tego testu. Radioligandy można wykorzystać do wykonania krzywych nasycenia, konkurencji i eksperymentów kinetycznych.

Wiązanie ligand-receptor

Wybierając radioligand, należy pamiętać o kilku czynnikach:

• Wysoka aktywność swoista: Radioligandy o wysokiej aktywności specyficznej dobrze nadają się do badań wiązania ligandów. Aktywność specyficzna wskazuje, ile radioaktywności przypada na cząsteczkę liganda i jest zwykle podawana w jednostkach Curies na milimol liganda. Kilka z naszych ligandów znakowanych 125I jest oferowanych z maksymalną aktywnością specyficzną (2200 Ci/mmol, jeśli dostępne jest jedno miejsce znakowania 125I, 4400 Ci/mmol, jeśli dostępne są dwa miejsca znakowania 125I, itd.) Wskazuje to, że praktycznie każda cząsteczka ligandu dostarczana w fiolce z zapasem jest znakowana radioaktywnie. Dla trytowanych ligandów (ligandów 3H) należy wybrać ligand, który ma aktywność właściwą powyżej 20 Ci/mmol. Maksymalna teoretyczna aktywność właściwa na tryt wynosi 29 Ci/mmol (Curies na milimol trytu). Aktywności specyficzne powyżej tej wartości wskazują, że średnio każda cząsteczka ligandu posiada co najmniej jeden tryt.
• Niskie wiązanie niespecyficzne: Ligandy hydrofobowe będą generalnie wykazywać wyższe wiązanie niespecyficzne. Może to być czasami kompensowane przez powlekanie filtrów BSA w celu zmniejszenia wiązania niespecyficznego. Włączenie BSA, soli lub detergentów do buforu płuczącego lub wiążącego może również pomóc w zmniejszeniu wiązania niespecyficznego. Jeżeli podstawowy materiał radiochemiczny jest pakowany w silanizowaną fiolkę (patrz arkusz danych technicznych), może to wskazywać, że ligand jest w pewnym stopniu hydrofobowy
• Wysoka czystość: Idealnie, ligand powinien mieć czystość radiochemiczną powyżej 90%. Czystość radiochemiczna zmniejsza się z czasem, a rzeczywiste tempo tej degradacji przyspiesza z czasem. Czystość radiochemiczną i współczynniki degradacji dla naszych różnych substancji radiochemicznych można znaleźć w kartach danych technicznych poszczególnych partii.
• Wysoka selektywność: Im bardziej selektywny jest ligand dla danego receptora, tym lepsze będą dane. Wysoka selektywność wskazuje, że ligand będzie rozpoznawany głównie przez tylko jeden interesujący receptor, ponad innymi receptorami, które mogą być obecne w błonie komórkowej. Również użycie membran, które nadmiernie eksprymują receptor zainteresowania może pomóc zredukować potencjalny wkład z receptorów endogennie wyrażonych w membranie.
• Stabilność: Jeśli będziesz musiał używać swojego radioznacznika przez dłuższy okres czasu, stabilność może być dla Ciebie czynnikiem. Ligandy znakowane 125I powinny być generalnie użyte w ciągu jednego do dwóch miesięcy od daty produkcji. Ligandy trytytanowe powinny być zwykle używane w ciągu 3-6 miesięcy od daty produkcji; istnieją jednak wyjątki od tej zasady. Szybkości degradacji i daty produkcji można znaleźć w naszych arkuszach danych technicznych dla poszczególnych serii. Można również skontaktować się z działem pomocy technicznej w celu omówienia zalecanego czasu stosowania dla każdego produktu radiochemicznego firmy PerkinElmer – nasze dane kontaktowe znajdują się w prawym górnym rogu tej strony.
• Energia: 3H uwalnia energię beta, którą można zmierzyć na liczniku scyntylacyjnym po dodaniu scyntylantu (w postaci koktajlu scyntylacyjnego, scyntylantu stałego Meltilex®, kulki SPA, itp.) Energia beta oddziałuje ze scyntylantem, wytwarzając fotony, które są mierzone przez detektor. 125I uwalnia zarówno energię podobną do beta jak i energię gamma. Jeżeli masz dostęp tylko do licznika gamma, powinieneś użyć radioligandu znakowanego 125I. Dodatkowym czynnikiem jest format badania. 125I wydziela więcej energii podobnej do beta niż 3H. Dla testów SPA, zarówno ligandy znakowane 3H jak i 125I mogą być efektywnie wykorzystywane.

Testy wiązania ligandów radioaktywnych mogą być wykonywane w kilku różnych formatach. Typowo, wykonujemy to badanie w formacie filtracji, ale badanie może być również wykonane w formacie SPA. Format SPA jest formatem homogenicznym, co oznacza, że nie są wymagane żadne etapy płukania. W teście filtracji, będziesz wypłukiwał niezwiązany ligand używając kolektora próżniowego lub kombajnu komórkowego.

Top

Formaty testów

Filtracyjne testy wiązania ligandów

Zobacz więcej informacji na temat potrzebnych materiałów, optymalizacji, które należy wykonać oraz referencji dla testów wiązania ligandów radioaktywnych na płytkach filtracyjnych. W formacie filtracyjnym, badanie wiązania jest przeprowadzane najpierw w jednej płytce testowej, a następnie filtrowane przez filtermat lub płytkę UniFilter® przy użyciu zbieracza komórek (kolektor próżniowy). Filtry są płukane w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych radioligandów. Płytka Filtermat lub UniFilter jest następnie suszona i dodawany jest koktajl scyntylacyjny (lub Meltilex®) przed odczytem w odpowiednim detektorze.

Zbadania wiązania ligandów SPA

Zobacz więcej informacji na temat potrzebnych materiałów, optymalizacji, które możesz potrzebować wykonać i referencji dla badań wiązania radioligandów SPA. W formacie SPA, błony komórkowe są wychwytywane na kulki SPA. Kiedy radioligand wiąże się z receptorem/membraną, powoduje to zbliżenie substancji radiochemicznej do kulki SPA. Energia beta pochodząca z radioligandu może oddziaływać ze scyntylantem w kulce, wytwarzając sygnał, który może być zmierzony. Radioligand, który nie jest związany z błoną komórkową, nie znajdzie się wystarczająco blisko kulki SPA, aby silnie oddziaływać ze scyntylantem.

Przegląd wiązania ligandów

Definicje

• Powinowactwo (siła działania): siła, z jaką ligand wiąże się z receptorem. Jest to zwykle wyrażone jako stała równowagi, Kd. Im niższa wartość Kd, tym wyższe powinowactwo.
• Swoistość: opisuje jak selektywny jest ligand dla jednego receptora w stosunku do innych podobnych receptorów
• Kd: stężenie, w którym 50% receptorów jest zajętych przez radioligand

Pharmacological Classifications for Ligands

Ligandy

• Pełny agonista: ligand, który wiąże się z receptorem i aktywuje go oraz wywołuje maksymalną odpowiedź
• Częściowy agonista: ligand, który wiąże się z receptorem i wywołuje submaksymalną odpowiedź
• Antagonista: ligand, który wiąże się z receptorem i nie aktywuje go. Antagoniści nie wywołują żadnej odpowiedzi, gdy są stosowane samodzielnie. Będą blokować działanie konkurencyjnego liganda agonistycznego.
• Agonista odwrotny: ligand, który wiąże się z receptorem i zmniejsza odpowiedź poniżej poziomu podstawowego

Badania

I. Eksperyment nasycenia: Mierzy równowagę wiązania poprzez wykonanie miareczkowania radioligandu, utrzymując stałą ilość receptora.

Można użyć krzywych nasycenia do wyznaczenia Bmax (poziom ekspresji receptora) i Kd (powinowactwo wiązania liganda).

Doświadczenie nasycenia

• Wiązanie całkowite: Zwiększanie stężenia radioligandu przy nieobecności zimnego liganda. Mierzy zarówno specyficzne wiązanie do receptora, jak i wiązanie niespecyficzne.
• Wiązanie niespecyficzne: Zwiększanie stężenia radioligandu w obecności zimnego liganda. Mierzy wiązanie radioligandu do elementów niereceptorowych.
• Wiązanie swoiste: Całkowite minus wiązanie niespecyficzne. Mierzy wiązanie do receptora, specyficznie.

II. Eksperyment konkurencji: Mierzy równowagę wiązania pojedynczego stężenia radioligandu w obecności różnych stężeń nieznakowanego konkurenta.

Można użyć krzywych konkurencji do określenia powinowactwa dużej liczby nieznakowanych związków do receptora w badaniach przesiewowych. IC50 i Ki mogą być wyprowadzone z danych o konkurencji.

Krzywa konkurencji

• IC50: stężenie liganda konkurencyjnego, który wypiera połowę liganda radioaktywnego
• Ki: powinowactwo zimnego liganda do receptora

Uwaga: przy zmianie stężenia liganda promieniotwórczego można zaobserwować przesunięcie IC50 związku referencyjnego; jednak Ki pozostaje takie samo.

III. Eksperymenty kinetyczne: Zmierz poziom wiązania w różnym czasie, aby wyznaczyć stałe szybkości asocjacji i dysocjacji radioligandu.

Kinetyka

• Nasycające stężenie liganda dodana ilość związana w czasie do wyznaczenia Kon
• Wysokie stężenie nieznakowanego konkurenta dodana ilość związana w czasie mierzona do wyznaczenia stałych szybkości asocjacji i dysocjacji. i spadek wiązania w czasie mierzony w celu wyznaczenia Koff

Top

Wskazówki i FAQ

Idealnie, będziesz chciał wybrać radioligand, który ma następujące właściwości:

• Wysoka aktywność specyficzna (> 20 Ci/mmol dla liganda tritowanego)
• Niskie wiązanie niespecyficzne (ligandy hydrofobowe będą generalnie wykazywać wyższe wiązanie niespecyficzne)
• Wysoka czystość (typowo > 90% czystości)
• Wysoka selektywność
• Stabilność (jeśli będziesz musiał używać swojego radioliganda przez dłuższy okres czasu, stabilność może być czynnikiem. Ligandy znakowane 125I powinny być generalnie zużyte w ciągu jednego do dwóch miesięcy od daty produkcji. Ligandy trytytanowe powinny być zazwyczaj używane w ciągu 3-6 miesięcy od daty produkcji (istnieją jednak wyjątki od tej zasady).

Przy wykreślaniu danych zalecamy stosowanie doświadczalnie ustalonego stężenia roztworów roboczych radioligandów, a nie obliczonego stężenia. Niektóre radioligandy będą przywierać do ścianek probówek rozcieńczalnikowych. Ważne jest, aby określić prawdziwe stężenie pipetowanego radioligandu. Aby doświadczalnie określić stężenie rozcieńczenia radioligandu, należy pobrać pipetą kilka mikrolitrów z probówki z rozcieńczeniem i nanieść na płytkę filtracyjną. Można również rozcieńczyć tę próbkę w stosunku 1:10, aby móc porównać wyniki. Określić dpms (disintegrations per minute). Przelicz z dpms na Curies używając następującego równania:

1 Ci = 2.22 x 1012 dpm

Potem użyj specyficznej aktywności twojej partii radioligandu do przeliczenia z Curies na mole. Aby określić stężenie promieniotwórcze w tym momencie, podziel liczbę moli przez objętość, którą naniosłeś na filtry.

FAQs

Q. Jakiego stężenia radioligandu powinienem użyć do mojej krzywej nasycenia?
A. Ogólnie zalecamy wybranie 3-5 stężeń poniżej Kd i 3-5 stężeń powyżej Kd. Najwyższe stężenie powinno być dziesięć razy większe od Kd.

Q.Jakie stężenie radioligandu należy wybrać do wiązania kompetycyjnego?
A. Radioligand jest stosowany w niskim stężeniu, zwykle na poziomie lub poniżej jego wartości Kd. Jeśli aktywność specyficzna jest niska, można zastosować stężenie powyżej wartości Kd, ale nigdy nie może być ono wyższe niż stężenie nasycające.

Q. Jakiego rodzaju ligandu powinienem użyć do określenia wiązania niespecyficznego w moich krzywych nasycenia?
A. Zazwyczaj chcesz wybrać ligand, który jest inny niż twój radioligand. Chcesz wyprzeć tylko specyficzne wiązanie radioligandu do receptora. Powinieneś wybrać ligand, który ma wysokie powinowactwo do miejsca wiązania receptora i niskie powinowactwo do niespecyficznych miejsc wiązania.

Top

Inne technologie wiązania receptorów-ligandów firmy PerkinElmer

• Testy wiązania fluorescencyjnych receptorów-ligandów DELFIA

Top

Radiochemikalia na zamówienie, linie komórkowe, Membrany, mrożone komórki i receptory

PerkinElmer oferuje niestandardowe produkty radiochemiczne, niestandardowe linie komórkowe i membrany, niestandardowe mikropłytki, kulki SPA i płytki FlashPlates, a także opracowywanie niestandardowych testów. Jeśli są Państwo zainteresowani usługami niestandardowymi, prosimy o kontakt z naszymi zespołami:

ON>POINT® Custom Assay Development Services

Top

.