PLOS ONE

Results and Discussion

Konstytutywna aktywacja czynnika transkrypcyjnego NF-κB jest uważana za niezbędną do transformacji komórek B przez białko fuzyjne API2-MALT1 chłoniaków MALT z translokacją t(11;18) . Przejściowa nadekspresja API2-MALT1 w komórkach 293T powoduje silną aktywację genu reporterowego lucyferazy NF-κB, zapewniając w ten sposób użyteczny system modelowy do badania mechanizmów, za pomocą których API2-MALT1 sygnalizuje NF-κB. Aby monitorować wydajność transfekcji, współekspresjonowaliśmy pEGFP-N2 (Clontech) w wielu eksperymentach. Ku naszemu zaskoczeniu zaobserwowaliśmy, że EGFP hamował aktywację NF-κB indukowaną przez API2-MALT1 w sposób zależny od dawki (Rys. 1A). W przeciwieństwie do tego, EGFP nie wpływał na aktywację reportera indukowaną przez ekspresję podjednostek p50/p65 NF-κB (ryc. 1B), sugerując zakłócenie kaskady sygnalizacyjnej NF-κB aktywowanej przez API2-MALT1 upstream of NF-κB.

(A) Aktywacja reportera lucyferazy NF-κB przez białko fuzyjne API2-MALT1 znakowane flagą jest hamowana przez EGFP w sposób zależny od dawki.

(B) EGFP nie blokuje aktywności lucyferazy zależnej od NF-κB indukowanej przez ekspresję podjednostek p50/p65 NF-κB (C) Aktywacja reportera lucyferazy NF-κB przez białko fuzyjne API2-MALT1 jest hamowana przez EGFP zmutowane dla motywu wiążącego TRAF6 (D) EGFP, ale nie pmaxGFP zapobiega indukowanej TNF-α aktywacji reportera lucyferazy NF-κB i fosforylacji IκB-α i JUN w komórkach 293T.

EGFP nie zwiększa poziomów HSP70 ani nie indukuje HSP70B′ w komórkach 293T.

intensywność fluorescencji (Ex485/Em520nm) dla EGFP i pmaxGFP była ∼100 razy większa od tła. (E) N- i/lub C-końcowe białka fuzyjne EGFP (dla API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, aktyny, Rab5, białka wiążącego syndekan 2 (SDCBP2) lub β-tubuliny) oraz EGFP z sygnałem lokalizacji jądrowej (NLS) lub miejscem farnylacji (pEGFP-F) zmniejszają indukowaną TNF-α aktywność reportera lucyferazy NF-κB w komórkach 293T. Bottom: U ludzi, HSP70 ulega konstytutywnej ekspresji w normalnych warunkach, ale Hsp70B′ jest indukowany tylko w odpowiedzi na stres.

Nie ma podstawowej ekspresji Hsp70B′.

Jako pozytywna kontrola dla ekspresji HSP70B′, komórki 293T (pas 2) zostały poddane szokowi termicznemu w 44°C przez dwie godziny (pas 3) i pozwolono im dojść do siebie w 37°C przez 5 (pas 4) lub 18 (pas 5) godzin przed zbiorem. Aktywność lucyferazy zależna od NF-κB jest przedstawiona dla każdego eksperymentu jako indukcja fold w stosunku do komórek transfekowanych wektorem i jest przedstawiona graficznie jako średnia i odchylenie standardowe co najmniej trzech niezależnych eksperymentów.

Wszystkie wzorce masy cząsteczkowej są w kDa.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001

MALT1 jest istotnym składnikiem sygnalizacyjnym ścieżki antygen-receptor w kierunku NF-κB . Uważa się, że BCL10 pośredniczy w oligomeryzacji MALT1, co umożliwia utworzenie kompleksu z TRAF6. Oligomeryzacja TRAF6 wywołuje aktywność ligazy ubikwitynowej E3 jego domeny RING, co prowadzi do modyfikacji IKKγ (NEMO) poprzez łańcuchy polibikwitynowe połączone z Lys63. Ułatwia to następnie interakcję IKKγ z kinazą aktywującą TGFβ 1 (TAK1), która w pełni aktywuje kompleks kinazy IκB (IKK) poprzez fosforylację IKKβ, prowadząc w ten sposób do aktywacji NF-κB. Podobnie, białko fuzyjne API2-MALT1 aktywuje NF-κB poprzez pośredniczoną przez TRAF6 polikwitynację IKKγ . Interakcja TRAF6 z karboksy-końcem MALT1 zachodzi poprzez dwa potencjalne motywy wiążące TRAF6 (PxExxAr/Ac z Ar/Ac dla reszty aromatycznej lub kwaśnej). Analiza sekwencji EGFP ujawniła obecność konsensusu wiążącego TRAF6 (PNEKRD, AA 212-217). Struktura krystaliczna EGFP pokazuje, że motyw PNEKRD jest wyeksponowany w pętli pomiędzy dwoma beta-szetami, co sugeruje jego dostępność i rolę EGFP jako negatywnego regulatora poprzez sekwestrację TRAF6. Jednak eksperymenty co-IP nie wykazały interakcji między EGFP i TRAF6 (dane nie pokazane), a mutanty dla konsensusu wiązania TRAF6 blokowały aktywację NF-κB przez API2-MALT1 tak skutecznie jak EGFP (Fig 1C).

Aby zbadać, czy efekt ten był ograniczony do API2-MALT1, przeanalizowaliśmy aktywację NF-κB indukowaną TNF-α w komórkach 293T wyrażających EGFP. Ponownie, EGFP zmniejszył sygnalizację NF-κB, jak wykazano przez niższą aktywność reportera i zmniejszoną fosforylację inhibitora NF-κB, IκB-α (Figura 1D). Następnie sprawdziliśmy, czy białka fuzyjne EGFP mogą mieć ten sam efekt. Zarówno N- jak i C-końcowa fuzja EGFP blokowała aktywację NF-κB wywołaną przez API2-MALT1 (dane nie pokazane) i TNFα (ryc. 1E). Poza aktywacją szlaku NF-κB, leczenie TNF-α wyzwala również sygnalizację JNK. Fosforylacja JUN, wskazująca na aktywację sygnalizacji JNK, jest zmniejszona przez EGFP również po leczeniu TNF-α (ryc. 1D).

Donoszono, że przedłużona wizualizacja komórek wyrażających GFP indukuje produkcję reaktywnych form tlenu, co może prowadzić do zmian fizjologicznych i ostatecznie do śmierci komórki. Co ciekawe, oba mutanty EGFP dla konsensusu wiążącego TRAF6 straciły zieloną fluorescencję, ale skutecznie hamowały sygnalizację NF-κB (Fig 1C). Co więcej, pmaxGFP (Amaxa Biosystems), strukturalnie odmienne białko fluorescencyjne, nie wpływało na aktywację NF-κB i JNK po traktowaniu TNF-α (ryc. 1D), co sugeruje, że inhibicja nie wynikała z fototoksyczności związanej z wolnymi rodnikami. Inne badanie wykazało, że wysoki poziom EGFP może indukować białko szoku cieplnego 70 (HSP70), które jest w stanie hamować aktywację NF-κB poprzez interakcję z IKKγ i TRAF6 . Jednakże indukcja HSP70 była ograniczona do komórek śródbłonka i nie zaobserwowaliśmy zwiększonego poziomu HSP70 lub indukcji HSP70B′ w komórkach 293T wyrażających EGFP (Fig. 1D-E).

Aktywacja NF-κB przez ekspresję API2-MALT1 lub po traktowaniu TNF-α jest związana z modyfikacją IKKγ polikwityną związaną z Lys63 odpowiednio przez TRAF6 lub TRAF2 . Ponadto sygnalizacja JNK indukowana TNFα wymaga auto-ubiquitynacji TRAF2. Aby ocenić możliwy wpływ EGFP na aktywność ligazy ubikwitynowej RING E3 TRAF6 lub TRAF2, monitorowaliśmy ubikwitynację za pomocą mutanta ubikwityny znakowanego HA, w którym tylko Lys63 jest dostępna do polimeryzacji (HA-Ub-K63). Ekspresja API2-MALT1 lub stymulacja TNF-α zwiększała poziom polikwitynowanych białek w komórkach 293T i była związana z nasiloną polikwitynacją IKKγ w immunoprecypitatach, a oba procesy były blokowane przez EGFP (Figura 2A, pasy 1,2,5,6). Ponadto EGFP zmniejszał podstawowy poziom polikwitynacji związanej z K63 w komórkach 293T (ryc. 2A, pasy 3 i 4). Podobnie, ekspresja API2-MALT1 lub traktowanie TNFα stymuluje tworzenie łańcucha ubikwityny związanego z K48, co ponownie jest blokowane przez EGFP i jego strukturalny homolog dsRed (Clontech), ale nie przez pmaxGFP (Fig 2B).

(A) Komórki 293T transfekowane wskazanymi konstruktami i traktowane przez 4 godziny 20 ng/ml TNF-α (pas 5 i 6) poddano immunoblotacji z przeciwciałami anty-Flag (API2-MALT1), anty-HA (HA-Ub-K63) i anty-EGFP (lewy panel) lub immunoprecypitaty anty-IKKγ poddano immunoblotacji z przeciwciałami anty-Flag (IKKγ) lub anty-HA (ubikwityna) (prawy panel).

(B) EGFP wpływa na polikwitynację związaną z K48.

Komórki 293T poddano transfekcji konstruktem ubikwityny z tylko Lys48 dostępnym do polimeryzacji (HA-Ub-K48), traktowano przez 4 godziny 20 ng/ml TNF-α lub pozostawiono bez leczenia, a lizaty komórkowe poddano immunoblotowi z przeciwciałami anty-HA (Ub-K48) i anty-EGFP.

Intensywności fluorescencji (ekscytacja 485/emisja 520 nm) dla EGFP i pmaxGFP były porównywalne (∼ 100 razy wyższe niż wartości tła), ekspresja pDs-Red została potwierdzona przez mikroskopię fluorescencyjną.

(C) EGFP stabilizuje egzogenny API2-Myc w komórkach 293T poprzez redukcję jego auto-ubiquitynacji związanej z Lys48 i degradacji proteasomalnej.

(D) Stabilna ekspresja EGFP w linii komórkowej raka komórek merkla MCC14.2 zmniejsza polubikwitynację i zwiększa poziom ekspresji endogennego p53.

Podano średni stosunek i odchylenie standardowe sygnałów p53 do aktyny (trzy niezależne eksperymenty), (Ub)n : białka polubikwitynowane.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002

Aby zbadać, czy EGFP wpływa wyłącznie na ubikwitynację przez białka TRAF, oceniliśmy API2, ligazę ubikwitynową RING E3, która destabilizuje się poprzez auto-ubikwitynację związaną z Lys48 . Współekspresja EGFP hamowała polikwitynację indukowaną przez API2 w komórkach 293T, powodując wzrost poziomu ekspresji API2 (ryc. 2C). Zmniejszone poziomy ubikwitynacji w stanie stacjonarnym obserwowano również w komórkach MCC14.2 ze stabilną ekspresją EGFP. W konsekwencji, podstawowe poziomy endogennego p53, które są ściśle regulowane poprzez ubikwitynację związaną z Lys48 przez MDM2, są nieznacznie zwiększone w komórkach wyrażających EGFP (Fig 2D).

Następnie sprawdziliśmy, czy EGFP wpływa na ubikwitynację in vivo. Podstawowe poziomy polikwitynacji zostały zmniejszone w limfocytach śledzionowych od myszy transgenicznych EGFP , co wiązało się ze zmniejszoną fosforylacją IκB-α po stymulacji antygenem w porównaniu z myszami kontrolnymi, wskazując, że EGFP zmniejsza aktywację NF-κB indukowaną receptorem komórek B (Figura 3A-B). Myszy transgeniczne API2-MALT1 mają deficyt komórek B B220+/CD40+ w szpiku kostnym, ponieważ aktywacja NF-κB wywołana przez API2-MALT1 przyspiesza ich dojrzewanie do naiwnych komórek B. Kiedy te transgeniczne myszy API2-MALT1 skrzyżowano z myszami EGFP, deficyt komórek B B220+/CD40+ w szpiku kostnym myszy podwójnie transgenicznych EGFP/API2-MALT1 (ryc. 3C) został przywrócony, co dodatkowo wspiera wpływ na ubikwitynację i sygnalizację NF-κB in vivo. Podobnie, polikwitynacja była zredukowana w komórkach wątroby myszy EGFP i była związana ze stabilizacją p53, jak wykazano przez wzrost poziomu jego ekspresji (Fig 3A, D). Głównym genem docelowym p53 w wątrobie po uszkodzeniu DNA wywołanym przez promieniowanie γ jest p21, który jest wymagany do zatrzymania cyklu komórkowego i naprawy DNA. W związku z tym, uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem γ powodowały nie tylko większą odpowiedź p53 u myszy EGFP, ale także indukcja p21 była nieznacznie zwiększona (ryc. 3D). Wreszcie przeprowadzono eksperymenty in vitro, aby ocenić, czy EGFP bezpośrednio wpływa na składanie łańcucha ubikwityny; jednak rekombinowany EGFP nie wpływał na polikwitynację substratu kontrolnego (Fig 3E), sugerując zależny od kontekstu komórkowego wpływ EGFP na ubikwitynację.

(A) Western blots ekstraktów śledziony i wątroby od myszy FVB wild-type (wt) i EGFP transgenicznych wykrywanych za pomocą przeciwciał przeciwko ubikwitynie, EGFP i aktynie (kontrola ładowania).

(B) EGFP zmniejsza fosforylację IκB-α w limfocytach B stymulowanych anty-IgM/anty-CD40 oczyszczonych z myszy EGFP.

Wykonania przeprowadzono w trzech egzemplarzach, pokazano reprezentatywny obraz jednego eksperymentu.

Podano średnią i odchylenia standardowe stosunku IκB-α-P do aktyny w stosunku do komórek niestymulowanych.

(C) Deficyt komórek B B220+/CD40+ w szpiku kostnym myszy API2-MALT1 jest przywrócony u myszy podwójnie transgenicznych EGFP/API2-MALT1.

Doświadczenia przeprowadzono w trzech egzemplarzach, przedstawiono średnią i odchylenia standardowe. eMalt1: endogenny Malt1, pasmo specyficzne dla *a (D) Myszy EGFP wykazują zwiększony poziom p53 w wątrobie i mają zwiększone odpowiedzi p53/p21 na uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem γ.

Podano średnie i odchylenia standardowe stosunku sygnałów p53/p21 do sygnału aktyny w odniesieniu do próbki 1.

(E) Rekombinowane EGFP (rEGFP) nie zapobiega polikwitynacji substratu biotyna-lizozym in vitro. (Ub)n: białka polubikwitynowane.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003

Podsumowując, nasze dane wskazują, że EGFP i białka fuzyjne EGFP wpływają na procesy zależne od ligazy ubikwitynowej RING E3, takie jak sygnalizacja NF-κB i JNK lub homeostaza p53 w liniach komórkowych i u myszy. NF-κB odgrywa centralną rolę w regulacji różnych procesów biologicznych, w tym odporności wrodzonej i adaptacyjnej, rozwoju, wzrostu i przeżycia komórek. Sygnały pro-życiowe wynikają z podwyższonej ekspresji inhibitorów apoptozy, takich jak B-cell leukaemia/lymphoma-XL. Dlatego wzrost apoptozy indukowany przez EGFP w komórkach lub w korze ruchowej i prążkowiu mózgu myszy może być związany z obniżoną aktywnością NF-κB z powodu defektu polikwitynacji i aktywacji/degradacji jego upstreamowych regulatorów. Defekt ubikwitynacji jest również postulowany jako przyczyna dystrofii mięśniowej obręczy kończyny, która jest związana z mutacjami w Trim32, ligazy ubikwitynowej dla aktyny. Ponieważ wykazano, że EGFP upośledza interakcje aktyna-miozyna w komórkach mięśniowych i wywołuje kardiomiopatię rozstrzeniową u myszy EGFP, kuszące jest spekulowanie, że ubikwitynacja aktyny może odgrywać istotną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu mięśni i że jej deregulacja przez EGFP powoduje wyżej wymienione fenotypy. Dlatego też, w świetle pojawiającej się roli ubikwitynacji w licznych procesach komórkowych, użycie EGFP jako reportera żywych komórek powinno być starannie rozważone.