Abstract

Mycobacterium genus powoduje wiele chorób odzwierzęcych. Najbardziej znanym przykładem jest zoonotyczna gruźlica wywołana przez M. bovis. Znacznie mniej wiadomo na temat prątków niegruźliczych (NTM), które są również związane z infekcjami u ludzi. Meksykański standard NOM-ZOO-031-1995 reguluje obecność M. bovis u bydła; nie ma jednak regulacji dotyczących gatunków NTM. Celem tego badania była izolacja i identyfikacja gatunków prątków niegruźliczych od bydła z lokalnych stad w południowym regionie Stanu Meksyk poprzez identyfikację i wykrywanie markera molekularnego 100 bp w genie 23S rRNA z następującym po nim sekwencjonowaniem genu 16S rRNA. Pobrano próbki mleka (35) i próbki wysięku z nosa (68). Spośród 108 wyizolowanych szczepów do identyfikacji wybrano 39. Trzynaście szczepów wyizolowanych z wysięku z nosa amplifikowało marker molekularny 100 bp i zostało zidentyfikowanych jako M. neoaurum (sześć szczepów), M. parafortuitum (cztery szczepy), M. moriokaense (dwa szczepy) i M. confluentis (jeden szczep). Z wyjątkiem M. parafortuitum, pozostałe zidentyfikowane gatunki stanowią zagrożenie dla zdrowia publicznego i weterynaryjnego, ponieważ są patogenne dla ludzi, zwłaszcza tych z chorobami podstawowymi.

1. Wprowadzenie

Rodzaj Mycobacterium wywołuje wiele różnych chorób odzwierzęcych. Najbardziej znanym przykładem jest gruźlica odzwierzęca wywołana przez M. bovis, dla której głównym rezerwuarem jest bydło. M. bovis jest częścią „kompleksu gruźliczego”, który obejmuje również gatunki M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae i M. microti .

W obrębie grupy prątków gruźlicy znajdują się „prątki niegruźlicze (NTM)”, które są również związane z infekcjami u ludzi. NTM występują w różnych źródłach środowiskowych, takich jak gleba, woda, roślinność, zwierzęta, produkty mleczne i odchody i mogą być przenoszone nieumyślnie przez wdychanie, spożycie lub penetrację skóry .

Meksykańska norma NOM-ZOO-031-1995 reguluje obecność M. bovis u bydła w celu kontroli i zwalczania gruźlicy bydła (bTB); jednakże nie istnieją żadne przepisy dotyczące gatunków NTM. Oficjalna diagnoza gruźlicy bydła w związku z obecnością M. bovis na poziomie terenowym opiera się na teście śródskórnym z użyciem oczyszczonej pochodnej białkowej (tuberkuliny). Test ten, choć stosowany od kilku lat, nie zapewnia dobrej czułości i swoistości. Około 20% zwierząt z gruźlicą nie reaguje na test, a obecność innych gatunków prątków, zarówno tuberculosis complex, jak i NTM, powoduje zakłócenia, które prowadzą do fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych diagnoz.

Chociaż w Meksyku obowiązują normy prawne, na niektórych obszarach odnotowano występowanie bTB przekraczające 2%. Biorąc pod uwagę niską swoistość i czułość próby tuberkulinowej, rzeczywista obecność M. bovis może być niższa, a wskaźnik zakażenia bydła przez inne prątki może być odpowiednio wyższy. Tak więc hodowcy bydła, lekarze weterynarii, technicy i pracownicy zatrudnieni w przemyśle hodowlanym mogą być zawodowo narażeni na zakażenia M. bovis i NTM. Bardzo niewiele wiadomo na temat narażenia zawodowego na choroby odzwierzęce wywołane przez gatunki NTM, ponieważ identyfikacja tych gatunków była dość trudnym zadaniem przed opracowaniem technik identyfikacji opartych na biologii molekularnej.

Obecnie, techniki biologii molekularnej najczęściej stosowane w diagnostyce chorób wywoływanych przez prątki to polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) w diagnostyce M. tuberculosis , spoligotypowanie do diagnozowania M. bovis , oraz wykrywanie „specyficznej insercji” o długości 100 par zasad (bp) zlokalizowanej w genie 23S rRNA charakterystycznej dla bakterii Gram-dodatnich o wysokiej zawartości guaniny-cytozyny (HGC), która jest uważana za marker molekularny dla tej grupy bakterii , a następnie analiza sekwencji genu 16S rRNA w celu identyfikacji bakterii na poziomie gatunku .

Wśród gatunków NTM zidentyfikowanych za pomocą wyżej wymienionych technik znajdują się M. balnei, M. marinum i M. platypoecilus, które wywołały powierzchowne i głębokie zmiany skórne; M. kansasii ze zmian w płucach; M. simiae z uogólnionych infekcji; M. scrofulaceum z zakażeń skóry i narządów wewnętrznych ; M. szulgai związany z zakażeniami płuc, zapaleniem kości i szpiku kostnego, zapaleniem błony maziowej i zapaleniem węzłów chłonnych ; M. ulcerans związany z ziarniniakami podskórnymi ; M. fortuitum i M. chelonae związane z zapaleniem naczyń, zapalenie wsierdzia, zapalenie kości i szpiku kostnego, zapalenie śródpiersia, zapalenie opon mózgowych, zapalenie rogówki i zapalenie wątroby, M. abscessus, związane z rumieniowych zmian, które przeszły do owrzodzonych guzków, i innych gatunków.

Największy odsetek inwentarza państwowego dla głów bydła w stanie Meksyk w Meksyku jest skoncentrowany w regionie południowym, a jedną z głównych działalności gospodarczych jest hodowla bydła. Meksykańskie rozporządzenie dotyczące kontroli bydła NOM-ZOO-031-1995 koncentruje się jedynie na próbie tuberkulinowej w celu rozpoznania M. bovis. Niewiele wiadomo na temat obecności NTM u bydła w tym regionie. Biorąc pod uwagę możliwość identyfikacji gatunków aktynobakterii poprzez wykrycie markera molekularnego 100 par zasad na genie 23S rRNA i późniejsze sekwencjonowanie genu 16S rRNA, możliwa jest identyfikacja wyżej wymienionych gatunków NTM.

Celem niniejszego badania była izolacja i identyfikacja gatunków NTM od bydła z południowego regionu stanu Meksyk. Gatunki Mycobacterium zostały wyizolowane z próbek wysięku z nosa i mleka bydlęcego i zidentyfikowane poprzez wykrycie 100-parowego markera molekularnego w genie 23S rRNA z późniejszym sekwencjonowaniem genu 16S rRNA.

2. Materiały i Metody

2.1. Pobieranie próbek

Pobieranie próbek przeprowadzono w oparciu o rozkład przestrzenny stad dodatnich na gruźlicę bydła w stanie Meksyk przeprowadzony przez Zaragoza i wsp. 2015 . Wybrano cztery stada bydła w południowym regionie stanu Meksyk, jedno stado należące do gminy Temascaltepec i trzy stada należące do gminy Zacazonapan. Łącznie pobrano 103 próbki, 35 próbek mleka i 68 próbek wysięku z nosa. Rozkład liczby i rodzaju próbek pobranych w każdym stadzie przedstawiono w tabeli 1.

.

.

.

.

Charakterystyka Herd 1 Herd 2 Herd 3 Herd 4 Total
Miasto Temascaltepec Zacazonapan Zacazonapan Zacazonapan
Rasa F1 Swiss-.Cebu Holstein Friesian Holstein Friesian Holstein Friesian
Położenie geograficzne La-19°03′13.7′′Lo-100°13′36.7′′ La-19°03′39.5′′Lo-100°16′30.9′′ La-19°04′0.4′′Lo-100°15′11.5′′ La-19°03′41′′Lo-100°16′06′′′
Historia występowania bTB Prewalencja Prewalencja Prewalencja Prewalencja Prewalencja
Uzyskane próbki
Mleko 15 20 0 0 35
Wysięk z nosa 0 18 23 27 68
103
La: szerokość geograficzna; Lo: długość geograficzna; bTB: gruźlica bydła. uzyskane od Komitetu ds. Promocji i Ochrony Zwierząt Gospodarskich Stanu Meksyk.
Tabela 1
Próbki pobrane w stadach bydła w południowym regionie Stanu Meksyk.

2.2. Uzyskanie próbek mleka i wysięku z nosa

Wymiona i sutki oczyszczono wodą oczyszczoną i mydłem, a następnie osuszono ręcznikami papierowymi, po czym przeprowadzono jałowość sutków za pomocą gazików nasączonych 70% alkoholem. Pięć mililitrów mleka pobierano bezpośrednio z sutka do sterylnych naczyń o pojemności 20 mL, odrzucając początkowy strumień. Wysięk z nosa pobierano bezpośrednio z wnętrza otworu nosowego za pomocą sterylnej wymazówki o długości 10 cm, którą następnie zanurzano w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej (0,85%). Próbki mleka i wysięku z nosa przechowywano w temperaturze 4°C do czasu opracowania.

2.3. Przetwarzanie próbek
2.3.1. Izolacja prątków

Próbki mleka odwirowywano przy 2500 obrotów na minutę (rpm) przez 10 minut. Osad z próbek mleka i wysięku z nosa inokulowano na następujące podłoże hodowlane selektywne dla prątków: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) i Middlebrook (BD BBL 254521) uzupełnione o 6 g pirogronianu sodu na litr (Middlebrook-P). Zaszczepione pożywki inkubowano w temperaturze 37°C przez 8 tygodni i oceniano co 3 dni.

2.3.2. Klasyfikacja wyizolowanych szczepów

Wyizolowane szczepy podzielono na grupy według następujących cech: pigmentacja kolonii, czas wzrostu i cechy kolonii (kształt, konsystencja, tekstura i produkcja pigmentu). Wyizolowane szczepy barwiono metodą Ziehl-Neelsena w celu potwierdzenia obecności pałeczek kwasoopornych (AFB) .

2.4. Ekstrakcja DNA

Do identyfikacji wybrano szczepy o cechach mikroskopowych podobnych do prątków gruźlicy (acid-fast pozytywność) oraz po dwa reprezentatywne szczepy z każdej grupy. W celu uzyskania biomasy szczepy inokulowano do 30 mL płynnego podłoża hodowlanego Middlebrooka (BD BBL 254521) w kolbach 125 mL i inkubowano w temperaturze 37°C przez 7 dni. Płynne podłoże przenoszono do sterylnych probówek Falcona o pojemności 15 mL i wirowano przez 15 minut przy 14 000 obr/min. Następnie usuwano supernatant, a osad przenoszono do probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 mL; probówki wirowano przy 14 000 rpm × 5 minut, a supernatant odrzucano. Ekstrakcję DNA przeprowadzono na otrzymanym osadzie przy użyciu zestawu Wizard Genomic DNA Purification (Promega A1120).

2.5. Wykrywanie markera molekularnego w genie 23S rRNA

Marker molekularny o długości 100 bp zlokalizowany na genie 23S rRNA amplifikowano zgodnie z metodyką opisaną przez Roller i wsp. (1992) przy użyciu następujących starterów: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, oraz 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

Reakcję przeprowadzono przy użyciu komercyjnej polimerazy Taq DNA (Promega M1661). Zastosowano następujące warunki termiczne cyklu: etap predenaturacji przez 5 minut (94°C); 29 cykli denaturacji przez 30 sekund (94°C), hybrydyzacji przez 45 sekund (46°C) i elongacji przez 50 sekund (72°C); i wreszcie cykl postelongacji przez 5 minut (72°C). Wzmocnione fragmenty potwierdzano na 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny (SIGMA 46065).

2.6. Amplifikacja genu 16S rRNA

Szczepy, które amplifikowały marker filogenetyczny o długości 100 bp zostały wybrane do analizy sekwencjonowania 16S rRNA. Do amplifikacji użyto następujących starterów: 8f: AGAGTTGATCMTGCTCAG i 1492r: TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

Reakcję przeprowadzono przy użyciu komercyjnej polimerazy Taq DNA (Promega M1661). Zastosowano następujące warunki cykli termicznych: jeden etap wstępnej denaturacji przez 5 minut (94°C); 34 cykle denaturacji przez 30 sekund (94°C), hybrydyzacji przez 20 sekund (52°C) i elongacji przez 1 minutę 30 sekund (72°C); i wreszcie cykl postelongacyjny trwający 7 minut (72°C).

Zmaksymalizowane fragmenty potwierdzono na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny (SIGMA 46065). Produkty tej amplifikacji oczyszczano przy użyciu zestawu Amicon Ultra Filter® (Millipore UFC901008) i potwierdzano na 1% żelu agarozowym, aby zweryfikować ich obecność i jakość.

2.7. Identyfikacja gatunków Mycobacterium Species

Zmplifikowane produkty genu 16S rRNA wysyłano do Macrogen Sequencing Service, Maryland, USA. Otrzymane sekwencje były analizowane i korygowane przy użyciu programu BioEdit . Z fragmentów forward i reverse skonstruowano sekwencje konsensusowe, które porównano z sekwencjami zdeponowanymi wcześniej w GenBanku National Center for Biotechnology Information (NCBI) przy użyciu programu BLAST oraz EzTaxon 2.1 .

2.8. Analiza filogenetyczna

Sekwencje genu 16S rRNA uzyskano dla następujących gatunków prątków z American Type Culture Collection (ATCC) oraz German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , i M. confluentis . Sekwencje szczepów z kolekcji oraz szczepów wyizolowanych w niniejszych badaniach zostały wyrównane przy użyciu programu BioEdit. Analizę filogenetyczną przeprowadzono przy użyciu metody maksymalnej parsymonii w programie MEGA w wersji 4. Do utworzenia korzenia kladogramu użyto sekwencji Pantoea agglomerans DSM 3493.

3. Wyniki

Sześćdziesiąt osiem szczepów wyizolowanych ze 103 zebranych próbek podzielono na 13 grup według ich makroskopowych i mikroskopowych cech morfologicznych (Tabela 2). Szczególnie grupy 11 i 12 składały się ze szczepów acid-fast.

.

.

.

.

.

.

Grupa Liczba szczepów Charakterystyka morfologiczna Molekularny marker (bp)
Makroskopowe Mikroskopowe 23S rRNA
Pigmentacja Wygląd Ziehl- 2 10 Biały Kremowy – 250
3 14 Biały Suchy – 250
4 2 Łososiowy Kremowy – 250
5 2 Salmon Dry – 250
6 2 White, ciemny Kremowy – 250
7 2 Biały Kremowy – 250
8 3 Biały, ciemna Sucha – 250
9 4 Biała Suche – 250
10 10 Białe Kremowe, suchy – 250
11 10 Biały Suchy + 350 i 250
12 7 Żółty Kremowy + 350
13 13 Biały Suchy – 250
-: brak pałeczek acid-fast; +: obecność pałeczek acid-fast; Bp: pary zasad.
Tabela 2
Isolowane szczepy pogrupowano według cech morfologicznych oraz obecności markera molekularnego (100 bp) na genie 23S rRNA.

Do identyfikacji na poziomie gatunku wybrano 39 szczepów: 10 z nich należało do grupy 11, a 7 do grupy 12. Z każdej z pozostałych 11 grup wybrano po dwa szczepy, aby uzupełnić liczbę 39 szczepów. Marker molekularny o długości 100 bp stwierdzono u 33% (13/39) wyselekcjonowanych szczepów. Dla nich amplifikowano gen 16S rRNA w celu sekwencjonowania i identyfikacji na poziomie gatunkowym.

Ogólna częstość występowania NTM w zebranych próbkach wynosiła 12,6% (13/103), biorąc pod uwagę zarówno mleko, jak i próbki wysięku z nosa. Jednakże, specyficzna prewalencja dla próbek wysięku z nosa wynosiła 19,1% (13/68).

Według porównania sekwencji, zidentyfikowano cztery gatunki NTM z rodzaju Mycobacterium; 64% (6/13) szczepów miało 98% i 99% podobieństwa do M. neoaurum, podczas gdy 31% (4/13) miało 99% podobieństwo z M. parafortuitum, 15% (2/13) miało podobieństwo 98% i 99% z M. moriokaense, i wreszcie 8% (1/13) miało 99% podobieństwo z M. confluentis (Tabela 3).

Rodzaj szczepu Pochodzenie ze stada Podłoże hodowlane Amplifikacja wielkość fragmentu (bp) Podobieństwo (Blast) % Podobieństwo (EzTaxon) %
1-.AZ 2 Middlebrook 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.3
2-AZ 2 Stonebrink 1408 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.1
3-AZ 2 Stonebrink 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.2
5-AZ 3 Stonebrink 1416 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.2
8-AZ 4 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.0
12-AZ 2 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.4
4-AZ 4 Middlebrook-P 1420 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
9-AZ 3 Middlebrook 1415 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.9
10-AZ 4 Stonebrink 1411 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.4
11-AZ 3 Stonebrink 1414 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
6-AZ 2 Stonebrink 1455 M. moriokaense 99 M. moriokaense 98.2
13-AZ 4 Stonebrink 1417 M. moriokaense 98 M. moriokaense 98.2
7-AZ 2 Middlebrook-P 1420 M. confluentis 99 M. confluentis 99.1
2: Zacazonapan Holstein-F; 3: Zacazonapan Holstein-F; 4: Zacazonapan Holstein-F.
Tabela 3
Porównanie sekwencji genu 16S rRNA szczepów wyizolowanych od bydła z sekwencjami udokumentowanymi w GenBank, przy użyciu BLAST i EzTaxon.

Z rodzaju Mycobacterium i czterech jego gatunków utworzono drzewo filogenetyczne, na podstawie którego zaobserwowano zależności filogenetyczne pomiędzy szczepami z kolekcji a szczepami wyizolowanymi w niniejszym badaniu (Rycina 1).

Rysunek 1
Drzewo filogenetyczne skonstruowane poprzez porównanie sekwencji genu 16S rRNA ze szczepów wyizolowanych i referencyjnych.

4. Dyskusja

Gatunki NTM zostały wyizolowane tylko z próbek wysięku z nosa, co wyeliminowało próbki z jednej z lokalnych farm w tym badaniu (Tabela 1). Stwierdziliśmy, że swoista prewalencja wynosiła 19,1% w stadach południowego regionu stanu Meksyk. Podobne badania w Stanach Zjednoczonych, Afryce Południowej, Tanzanii i Brazylii wykazały wartości prewalencji NTM wynoszące odpowiednio 3,4%, 24,5%, 7% i 7,8%; zatem wartość prewalencji stwierdzona w tym badaniu mieści się w zakresie podanym wcześniej. W tym badaniu 13 z 39 analizowanych szczepów zostało zidentyfikowanych jako gatunki NTM: M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis i M. parafortuitum.

M. neoaurum, członek kompleksu Mycobacterium parafortuitum, jest odpowiedzialny za szerokie spektrum chorób, z których większość to zakażenia związane z urządzeniami, takimi jak cewniki Hickmana, cewniki BROVIAC, linie PICC, przetoki tętniczo-żylne, które obejmowały przeszczep politetrafluoroetylenowy, pace makery i zapalenie wsierdzia zastawek protetycznych. Głównymi żywicielami są pacjenci z obniżoną odpornością, posiadający te urządzenia, na przykład pacjenci cierpiący na raka i diabetycy z niewydolnością nerek i problemami z sercem. M. neoaurum został również wyizolowany od pacjentów z zakażeniami układu moczowego, zapaleniem opon mózgowych i zmianami w ośrodkowym układzie nerwowym, bakteriemią i zapaleniem wsierdzia oraz zakażeniem płuc. Chociaż został on głównie wyizolowany z przypadków klinicznych, istnieją również doniesienia o jego izolacji z mleka i bydła .

M. moriokaense został wyizolowany z próbki plwociny . Chociaż jest on uważany za niepatogenny dla ludzi, został powiązany z chorobami płuc. M. confluentis został wyizolowany z próbek plwociny, jak również, wraz z M. parafortuitum, oba są uważane za gatunki niepatogenne. M. confluentis, M. moriokaense i M. neoaurum zostały wyizolowane z różnych tkanek bydła i zwierząt dzikich ze zmianami gruźliczymi, podczas gdy M. parafortuitum został wyizolowany tylko z mleka bydlęcego. Jednakże, w naszej pracy, M. parafortuitum został wyizolowany tylko z próbek wysięku z nosa.

Wymagania odżywcze prątków różnią się pomiędzy różnymi gatunkami, co było powodem użycia różnych podłoży hodowlanych. Warto zauważyć, że siedem z 13 szczepów zidentyfikowanych w tym badaniu zostało wyizolowanych na podłożu Stonebrink, w tym M. neoaurum, M. parafortuitum i M. moriokaense. Wynik ten jest zgodny z tym opisanym przez Sepúlveda et al., którzy wskazali, że podłoże Stonebrink jest odpowiednie do odzyskiwania różnych gatunków rodzaju Mycobacterium. García-Martos i García-Agudo podali, że podłoże Middlebrook jest optymalne do izolacji actinomycetes, co jest zgodne z obecnym badaniem, biorąc pod uwagę, że dwa gatunki, M. neoaurum i M. parafortuitum, zostały wyizolowane na tym podłożu. Warto zauważyć, że M. confluentis izolowano tylko na podłożu Middlebrooka uzupełnionym pirogronianem sodu; tak więc strategia stosowania różnych podłoży hodowlanych była właściwa, ponieważ pozwalała na izolację różnych gatunków z rodzaju Mycobacterium.

Wykrywanie markera molekularnego obecnego w genie 23S rRNA bakterii Gram-dodatnich z zawartością HGC pozwalało na dyskryminację pomiędzy szczepami eubakterii i prątków. Analiza sekwencjonowania genu 16S rRNA umożliwiła identyfikację na poziomie gatunkowym, dlatego połączenie tych metodologii jest odpowiednie do identyfikacji gatunków NTM.

5. Wnioski

Przy zastosowaniu metodyki opisanej w niniejszej pracy wyizolowano i zidentyfikowano cztery gatunki NTM: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum i M. parafortuitum. Gatunki te zostały wyizolowane po raz pierwszy z wysięków z nosa bydła z południowego regionu stanu Meksyk. Trzy spośród zidentyfikowanych gatunków (M. neoaurum, M. moriokaense, i M. confluentis) mają znaczenie dla zdrowia publicznego i weterynarii.

Ujawnienie

Praca ta pochodzi z rozprawy na stopień doktora nauk medycznych (Universidad Autónoma del Estado de México), zarejestrowanej w PNPC-CONACYT.

Konflikty interesów

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za pomoc finansową od Sekretarza Badań i Studiów Zaawansowanych Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) poprzez następujące granty badawcze: (i) „Implementacja systemów informacji geograficznej i technik biologii molekularnej, jako narzędzi w wykrywaniu i identyfikacji Mycobacterium spp.”, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, oraz (ii) sieć „Microbiología y química en las Ciencias de la Salud,” 039/2014RIF.

.