Choosing proper restriction enzymes based on defined criteria
W celu przejścia do zwięzłego przykładu, białko fluorescencyjne tdTomato zostało sklonowane do wektora alfaretrowirusowego. Następnie wygenerowano linię komórkową białaczki murine wyrażającą tdTomato. Ta linia komórkowa będzie używana do śledzenia komórek nowotworowych po wstrzyknięciu ich myszom w przedklinicznych badaniach immunoterapii. Jednakże ta metoda klonowania może być zastosowana do każdego innego genu. Aby rozpocząć projekt klonowania, gen zainteresowania (GOI) powinien zostać przeanalizowany. W pierwszej kolejności sprawdzamy, czy nasza anotowana sekwencja posiada kodon startu (ATG, najczęstszy kodon startu) oraz jeden z trzech kodonów stopu (TAA, TAG, TGA). W przypadku, gdy gen został wcześniej zmanipulowany lub połączony z innym genem (np. poprzez sekwencję 2A), zdarza się, że interesujący nas gen może nie posiadać kodonu stop. W takich przypadkach kodon stop musi być dodany na końcu anotowanej sekwencji. Korzystne jest również sprawdzenie, czy dany GOI zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF). Jest to ważne, ponieważ częste manipulowanie sekwencjami przez oprogramowanie lub poprzez klonowanie może spowodować błędne dodawanie lub usuwanie nukleotydów. Używamy oprogramowania Clone Manager (SciEd) do znalezienia ORF w naszych sekwencjach plazmidowych; jednakże, istnieje kilka darmowych stron internetowych, które można wykorzystać do znalezienia ORF, w tym NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
Gen tdTomato zawiera kodon startowy ATG i kodon końcowy TAA (Rysunek 1). Rozmiar genu tdTomato wynosi 716 bp.
Przegląd początku i końca interesującego nas genu. (A) Przedstawiono sekwencje nukleotydów na początku i na końcu genu tdTomato. Nukleotydy nici kodującej są wyszczególnione pogrubioną czcionką (B) Pokazano sekwencje nukleotydów starterów forward i reverse zawierających odpowiednie miejsca enzymów restrykcyjnych oraz sekwencję Kozaka.
W kolejnym kroku, startery PCR, które zawierają odpowiednie miejsca enzymów restrykcyjnych muszą być zaprojektowane do amplifikacji GOI. Aby wybrać optymalne enzymy restrykcyjne należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów. Po pierwsze, miejsca wiążące dla enzymów restrykcyjnych powinny być w idealnym przypadku dostępne w miejscu wielokrotnego klonowania w obrębie wektora. Alternatywnie mogą być one zlokalizowane poniżej promotora w sekwencji wektora. Enzymy restrykcyjne powinny być pojedyncze (single cutters) (single cutters celują tylko w jedno miejsce restrykcyjne w sekwencji DNA) (Rysunek 2A). Jeśli są one podwójne lub wielokrotne, powinny ciąć w obrębie sekwencji, która nie jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania plazmidu wektorowego i zostanie ostatecznie usunięta (Rysunek 2B). Możliwy jest również wybór jednego enzymu podwójnie tnącego lub wielokrotnie tnącego, tnącego wektor poniżej promotora i również nie w obrębie istotnej sekwencji plazmidu (Rysunek 2C). Enzymy typu double cutter lub multiple cutter posiadają odpowiednio dwa lub więcej miejsc restrykcyjnych na sekwencji DNA. Cięcie wektora za pomocą podwójnego lub wielokrotnego cuttera spowodowałoby powstanie dwóch identycznych końców. W takim przypadku kaseta insercyjna powinna również zawierać te same miejsca enzymów restrykcyjnych na obu swoich końcach. Dlatego, gdy fragmenty insercji i wektora s± wymieszane w eksperymencie ligacji, insercja może ulec fuzji z wektorem we wła¶ciwej orientacji (od kodonu startu do kodonu stopu) lub odwrotnej (od kodonu stopu do kodonu startu). Trzeci scenariusz może mieć miejsce, gdy fragment wektora tworzy samozwi±zuj±cy się kr±g z pominięciem insertu. Po inkubacji DNA z enzymami restrykcyjnymi, deposforylacja końców 5′ i 3′ plazmidu wektorowego przy użyciu enzymu fosfatazy alkalicznej znacznie zmniejszy ryzyko samozwiązania. Dlatego ważne jest, aby przesiewać produkt klonowania dla tych trzech produktów (właściwa orientacja, odwrotna orientacja, samoligacja) po ligacji fragmentu.
Wybór właściwych enzymów restrykcyjnych w oparciu o zdefiniowane kryteria dla klonowania PCR. (A) Dwa jednocięte enzymy restrykcyjne (E1 i E2) znajdują się poniżej promotora. (B) Enzymy restrykcyjne E1 i E2 tną plazmid poniżej promotora kilka razy (tu dwa razy dla każdego enzymu). (C) Enzym restrykcyjny E1 tnie plazmid poniżej promotora więcej niż jeden raz. (D) Produkt PCR, który zawiera gen tdTomato i miejsca enzymu restrykcyjnego, został rozprowadzony na żelu przed ekstrakcją do dalszych zastosowań.
Po drugie, ze względu na wyższą wydajność klonowania przy użyciu fragmentów DNA o lepkim końcu, pożądane jest, aby przynajmniej jeden (lepiej oba) z enzymów restrykcyjnych był tak zwanym obcinaczem lepkiego końca. Cutery lepkich końców rozcinają DNA asymetrycznie generując komplementarne, spójne końce. W przeciwieństwie do nich, tępy koniec tnie sekwencję symetrycznie, nie pozostawiając nawisów. Klonowanie fragmentów z tępym końcem jest trudniejsze. Niemniej jednak, wybór wyższego stosunku molowego insert/wektor (5 lub więcej) i użycie 10% glikolu polietylenowego (PEG) może poprawić ligację fragmentów z tępym końcem.
Po trzecie, niektóre enzymy restrykcyjne nie tną metylowanego DNA. Większość szczepów E. coli zawiera metylazy Dam lub Dcm, które metylują sekwencje DNA. Czyni je to odpornymi na działanie enzymów restrykcyjnych wrażliwych na metylację. Ponieważ wektorowe DNA jest w większości przygotowywane w E. coli, będzie ono metylowane. Dlatego unikanie enzymów restrykcyjnych wrażliwych na metylację jest pożądane; jednakże, czasami izoschizomer enzymu restrykcyjnego wrażliwego na metylację jest odporny na metylację. Na przykład, enzym Acc65I jest wrażliwy, podczas gdy jego izoschizomer kpnI jest oporny na metylację. Izoschizomery to enzymy restrykcyjne, które rozpoznają te same sekwencje nukleotydów. Jeśli nie ma innej możliwości niż użycie enzymów restrykcyjnych wrażliwych na metylację, DNA wektora należy przygotować w szczepach dam – dcm – E. coli. Listę tych szczepów, a także powszechnie stosowanych do klonowania molekularnego szczepów gospodarzy E. coli, zestawiono w tabeli 1. Informacje dotyczące wrażliwości enzymów restrykcyjnych na metylację są zwykle podawane przez producenta.
Po czwarte, ułatwia to klonowanie, jeśli bufor niezbędny do pełnej funkcjonalności enzymów restrykcyjnych jest taki sam, ponieważ można wykonać podwójne trawienie restrykcyjne. Oszczędza to czas i zmniejsza straty DNA podczas oczyszczania. Może się zdarzyć, że jeden z enzymów restrykcyjnych jest aktywny w jednym buforze, a drugi enzym jest aktywny w dwukrotnie większym stężeniu tego samego buforu. Na przykład enzym NheI firmy Thermo Scientific jest aktywny w buforze Tango 1X (Thermo Scientific), a enzym EcoR1 jest aktywny w buforze Tango 2X (Thermo Scientific). W takich przypadkach, plazmidowe DNA musi być najpierw strawione przez enzym wymagający wyższego stężenia buforu (tutaj EcoR1). Następnie w tym samym buforze rozcieńcza się bufor dla kolejnego enzymu (wymagającego niższego stężenia (tu NheI)). Jednak pojawienie się uniwersalnych buforów uprościło podwójne trawienie sekwencji DNA. W naszym przykładzie wektor zawiera miejsca restrykcyjne AgeI i SalI. Te miejsca enzymatyczne zostały wykorzystane do zaprojektowania starterów PCR (Rysunek 1). Dla prawidłowego trawienia enzymami restrykcyjnymi istotna jest wysoka czystość plazmidu. Absorpcja DNA mierzona przez spektrofotometr może być użyta do określenia czystości po oczyszczeniu. DNA, białka i rozpuszczalniki absorbują odpowiednio przy 260 nm, 280 nm i 230 nm. Stosunek OD 260/280 wynoszący >1,8 oraz stosunek OD 260/230 wynoszący 2 do 2,2 jest uważany za czysty dla próbek DNA. Stosunki OD 260/280 i 260/230 naszych przykładowych preparatów plazmidowych wynosiły odpowiednio 1,89 i 2,22. Zaobserwowaliśmy, że czystość wyekstrahowanych w żelu fragmentów wektora i insertowego DNA była niższa po trawieniu restrykcyjnym; ligacja działa nawet w takich przypadkach, jednak lepszych wyników można oczekiwać stosując fragmenty o wysokiej czystości.
Następujące strony internetowe repozytorium plazmidów mogą być przydatne do wyboru różnych wektorów (wirusowa ekspresja i pakowanie, puste szkielety, białka fluorescencyjne, wektory indukowalne, znaczniki epitopowe, białka fuzyjne, geny reporterowe, systemy ekspresji specyficzne dla gatunku, markery selekcyjne, promotory, ekspresja shRNA i inżynieria genomowa):http://www.addgene.org/browse/.
Zbiór wektorów do klonowania E. coli jest dostępny na następującej stronie internetowej:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Projektowanie starterów do klonowania w oparciu o zdefiniowane kryteria
Do projektowania starterów PCR, sprawdź kodony startu i stopu twojego GOI. Znaleźć sekwencję pożądanych enzymów restrykcyjnych (dostępne na stronach internetowych producentów) dla primera forward (Rysunek 3A). Musi ona znajdować się przed GOI (Rysunek 1B). Tzw. sekwencja Kozaka występuje w eukariotycznych mRNA i usprawnia inicjację translacji. Korzystne jest dodanie sekwencji Kozaka (GCCACC) przed kodonem startowym ATG, ponieważ zwiększa ona translację i ekspresję interesującego nas białka u eukariotów. Dlatego wstawiliśmy GCCACC bezpośrednio po sekwencji enzymu restrykcyjnego AgeI i przed kodonem startu ATG. Następnie, pierwsze 18 do 30 nukleotydów GOI począwszy od kodonu startu ATG jest dodawane do sekwencji primera forward. Te nakładaj±ce się na siebie nukleotydy wi±ż±ce się z szablonowym DNA wyznaczaj± temperaturę annealingu (Tm). Ta ostatnia jest zwykle wyższa niż 60°C. W tym przypadku używamy polimerazy Phusion high-fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific). W celu określenia optymalnej Tm można skorzystać z następujących stron internetowych:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Projektowanie starterów w oparciu o zdefiniowane kryteria dla klonowania PCR. (A-B) Przedstawiono sekwencje primera forward i primera reverse. Koniec nici kodującej ma być przekształcony do formatu dopełnienia odwrotnego w celu zaprojektowania primera odwrotnego. Aby uzyskać więcej informacji, proszę zapoznać się z tekstem.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
Tm naszego primera forward wynosi 66°C.
Wybierz ostatnie 18 do 30 nukleotydów, włączając w to kodon stop twojego GOI do zaprojektowania primera reverse (Rysunek 3B). Następnie obliczyć Tm dla tej sekwencji, które powinno być powyżej 60°C i zbliżone do Tm primera forward. Tm nakładającej się sekwencji naszego primera odwrotnego wynosiło 68°C. Następnie dodajemy sekwencję docelową drugiego miejsca enzymu restrykcyjnego (w tym przypadku SalI) zaraz za kodonem stop. Na koniec konwertujemy tak złożoną sekwencję do sekwencji odwrotnie komplementarnej. Następujące strony internetowe mogą być użyte do określenia sekwencji primera odwrotnego:
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis jest ważne, ponieważ primer odwrotny wiąże się z nicią kodującą i dlatego jego sekwencja (5′ → 3′) musi być odwrotnie komplementarna do sekwencji nici kodującej (Rysunek 1A).
Przeprowadzanie PCR przy użyciu polimeraz korekcyjnych
Ponieważ reakcja PCR następuje po logarytmicznej amplifikacji sekwencji docelowej, każdy błąd replikacji podczas tego procesu będzie amplifikowany. Współczynnik błędów niereadingowych polimeraz DNA, takich jak polimeraza Taq, wynosi około 8 × 10-6 błędów/bp/cykl PCR; jednakże enzymy proofreadingowe, takie jak polimeraza Phusion, mają zgłoszony współczynnik błędów na poziomie 4,4 × 10-7 błędów/bp/cykl PCR. Ze względu na jej wyższą wierność i procesywność, w tym przykładzie zastosowano polimerazę DNA Phusion. Należy zauważyć, że Phusion ma inne wymagania temperaturowe niż inne polimerazy DNA. Tm primera dla Phusion jest obliczane w oparciu o metodę Breslauera i jest wyższe niż Tm przy użyciu polimeraz Taq lub pfu. Aby uzyskać optymalne wyniki, Tm powinno być obliczane w oparciu o informacje znajdujące się na stronach internetowych dostawców enzymów. Ponadto, ze względu na większą szybkość reakcji Phusion, 15 do 30 sekund jest zwykle wystarczające do amplifikacji każdego kb interesującej nas sekwencji.
Po PCR, produkt należy umieścić na żelu (Rysunek 2D). Odpowiednie pasmo musi zostać przecięte, a DNA wyekstrahowane. Niezbędne jest sekwencjonowanie produktu PCR, ponieważ produkt PCR może zawierać mutacje. Dostępnych jest kilka zestawów do klonowania PCR, z których niektóre przedstawiono w Tabeli 2. My użyliśmy wektora klonującego pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, publikacja patentowa: US 2009/0042249 A1, Genbank accession number EF694056.1) i sklonowaliśmy produkt PCR do wektora linearyzowanego. Wektor ten zawiera gen letalny (eco47IR), który jest aktywowany w przypadku, gdy wektor ulegnie kolokalizacji. Jednakże, jeśli produkt PCR zostanie sklonowany do miejsca klonowania w obrębie genu letalnego, gen ten zostanie przerwany, co umożliwi bakteriom tworzenie kolonii po transformacji. Wektory koliste niezawierające produktu PCR wykazują ekspresję genu toksycznego, który zabija bakterie, uniemożliwiając im tworzenie kolonii. Klony bakteryjne należy następnie poddać hodowli, kolejno wyizolować plazmidowe DNA i poddać sekwencjonowaniu. Jakość wyizolowanego plazmidu jest niezbędna do uzyskania optymalnych wyników sekwencjonowania. Plazmidowe DNA wyizolowaliśmy z 1,5 ml wyhodowanych bakterii (wydajność 6 μg DNA; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) przy użyciu zestawu do izolacji plazmidów (QIAGEN). Cały proces PCR, w tym klonowanie produktu PCR do wektora sekwencjonującego oraz transfekcja bakterii wektorem sekwencjonującym może być wykonana w ciągu jednego dnia. Następnego dnia klony bakteryjne będą hodowane przez noc przed wysłaniem ich do sekwencjonowania.
Analiza danych z sekwencjonowania
Firmy zajmujące się sekwencjonowaniem zwykle przekazują dane z sekwencjonowania jako plik FASTA, a także jako gotowe sekwencje nukleotydów za pośrednictwem poczty elektronicznej. Do analizy sekwencji można użyć następujących stron internetowych:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Tutaj skupimy się na pierwszej stronie. Na tej stronie klikamy na opcję „nucleotide blast” (Rysunek 4A). Otworzy się nowe okno. Domyślnie, opcja „blastn” (blast nucleotide sequences) jest zaznaczona (Rysunek 4B). Następnie zaznaczamy pole za opcją „Align two or more sequences” (Wyrównaj dwie lub więcej sekwencji). Teraz pojawią się dwa pola. W polu „Enter Query Sequence” (górne pole), wstawić żądaną sekwencję interesującego nas genu, która jest otoczona miejscami restrykcyjnymi, które zostały już zaprojektowane dla primerów PCR. W polu „Enter Subject Sequence” (dolne pole), wprowadzić sekwencję lub załadować plik FASTA otrzymany od firmy sekwencjonującej. Następnie kliknąć przycisk „BLAST” u dołu strony. Po kilku sekundach wyniki zostaną wyświetlone na innej stronie. Część danych wyrównania pokazana jest na Rysunku 4C. W celu interpretacji należy wziąć pod uwagę następujące punkty: 1) liczba identycznych nukleotydów (podana w pozycji „Identyfikacje”) musi być równa liczbie nukleotydów interesującego nas genu. W naszym przykładzie liczba nukleotydów genu tdTomato wraz z nukleotydami miejsc enzymów restrykcyjnych i sekwencji Kozaka wynosiła 735. Odpowiada to liczbie podanej w raporcie (Rysunek 4C). 2) Identyczność sekwencji (w pozycji „Identities”) powinna wynosić 100%. Czasami identyczność sekwencji wynosi 100%, ale liczba identycznych nukleotydów jest mniejsza niż oczekiwana. Może się to zdarzyć, jeśli jeden lub więcej początkowych nukleotydów jest nieobecny. Należy pamiętać, że wszystkie technologie sekwencjonowania mają pewien poziom błędu. W przypadku sekwencjonowania metodą Sangera ten współczynnik błędu wynosi od 0,001% do 1%. Substytucja, delecja lub insercja nukleotydu może być zidentyfikowana poprzez analizę wyników sekwencjonowania. Dlatego, jeśli identyczność sekwencji nie osiąga 100%, plazmid powinien być ponownie sekwencjonowany w celu odróżnienia błędów PCR od prostych błędów sekwencjonowania. 3) Luki (w pozycji „Gaps”) nie powinny występować. W przypadku wystąpienia luk, plazmid powinien być ponownie sekwencjonowany.
Analiza sekwencji produktu PCR przy użyciu platformy NCBI BLAST. (A) Na stronie NCBI BLAST wybrana została opcja „nucleotide blast” (zaznaczona owalną linią). (B) Opcja „blastn” pojawia się domyślnie (zaznaczona kółkiem). Sekwencję interesującego nas genu (otoczoną miejscami restrykcyjnymi zaprojektowanymi wcześniej dla primerów PCR) oraz produkt PCR należy wprowadzić do pól „Enter Query Sequence” i „Enter Subject Sequence”. Sekwencje mogą być również załadowane jako pliki FASTA. (C) Pokazane jest wyrównanie pierwszych 60 nukleotydów. Dwie ważne pozycje dla analizy sekwencji są zaznaczone owalnymi liniami.
Średnia długość odczytu, lub długość odczytu, wynosi co najmniej 800 do 900 nukleotydów dla sekwencjonowania Sangera. W przypadku wektora pJET do sekwencjonowania kompletnego genu należy użyć jednego primera forward i jednego reverse. Startery te mogą zwykle pokryć gen o rozmiarze do 1800 bp. Jeśli rozmiar genu jest większy niż 1800, należy zaprojektować dodatkowy primer na każde 800 dodatkowych nukleotydów. Ponieważ wiarygodne wywoływanie zasad nie zaczyna się bezpośrednio po primerze, ale około 45 do 55 nukleotydów w dół od primera, następny forward primer powinien być zaprojektowany tak, aby zaczynał się po około 700 nukleotydach od początku genu. Do zaprojektowania tych starterów można wykorzystać różne strony internetowe, w tym następujące:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Przy długości 735 bp, rozmiar produktu PCR w tym przykładzie mieścił się w zakresie starterów sekwencjonowania pJET.
Po wybraniu zweryfikowanego sekwencyjnie klonu, plazmidy wektorowe i insertowe były trawione enzymami restrykcyjnymi AgeI i SalI (Rysunek 5). Następnie przeprowadzono oczyszczanie w żelu i ligację fragmentów. Transformacja kompetentnej E. coli z mieszaniną ligacyjną dała kilka klonów, które zostały przebadane przy użyciu enzymów restrykcyjnych. Oceniliśmy osiem klonów, z których wszystkie zawierały insert tdTomato (Rysunek 6). Ważne jest, aby wybierać klony, które są duże. Klony satelitarne mogą nie mieć właściwego konstruktu. Do ekstrakcji plazmidu z 0,6 ml zawiesiny bakteryjnej użyliśmy szybkiego zestawu do mini przygotowania plazmidu (Zymo Research). Wydajność i czystość były zadowalające dla badań przesiewowych opartych na enzymach restrykcyjnych (2,3 μg DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). Do oczyszczania plazmidu na dużą skalę użyto zestawu maxi-preparation (QIAGEN) do ekstrakcji plazmidu z 450 ml hodowli bakteryjnej (wydajność 787 μg DNA; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). Oczekiwana wydajność izolacji plazmidu pochodzącego z pBR322 z 1,5 ml i 500 ml hodowli bakteryjnej wynosi odpowiednio około 2-5 μg i 500-4000 μg DNA.
Mapy wektora i plazmidu insercyjnego A) Ilustracja plazmidu CloneJET zawierającego produkt PCR. Wstawienie produktu PCR do miejsca klonowania plazmidu zaburza integralność toksycznego genu eco47IR i umożliwia wzrost klonów pozytywnych dla transgenu. Plazmid pocięto enzymami AgeI i SalI generując dwa fragmenty o wielkości 3 kb i 0,7 kb. Fragment 0.7 kb (gen tdTomato) został użyty jako insert do klonowania. (B) Ilustracja plazmidu wektorowego. Plazmid pocięto enzymami AgeI i SalI generując dwa fragmenty o wielkości 4,9 kb i 0,7 kb. Fragment 4,9 kb został użyty jako wektor do klonowania. AMP: gen oporności na ampicylinę; PRE: potranskrypcyjny element regulatorowy; MPSV: promotor wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego.
Przesiewanie końcowego plazmidu enzymami restrykcyjnymi. Ilustracja przedstawia końcowy plazmid. W celu przesiewu, plazmid pocięto enzymem BsiwI generując dwa fragmenty o rozmiarach 4,8 kb i 0,8 kb. AMP: gen oporności na ampicylinę; PRE: posttranskrypcyjny element regulatorowy; MPSV: promotor wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego.
Niektóre plazmidy mają tendencję do rekombinacji wewnątrz gospodarza bakteryjnego tworząc insercje, delecje i rekombinacje. W tych przypadkach, użycie E. coli z niedoborem recA może być użyteczne (Tabela 1). Ponadto, jeśli GOI jest toksyczny, inkubacja bakterii w niższych temperaturach (25-30°C) i użycie szczepów ABLE C lub ABLE K może ominąć problem.
Wirusowa produkcja i transdukcja komórek docelowych
Aby zbadać ekspresję in vitro sklonowanego genu, komórki HEK293T zostały transfekowane plazmidami kodującymi gen tdTomato, alfaretrowirusowy Gag/Pol, oraz otoczkę glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSVG). Komórki te, pochodzące z ludzkiej nerki embrionalnej, są łatwe w hodowli i łatwo ulegają transfekcji. Dlatego też są one szeroko wykorzystywane w biotechnologii i terapii genowej do generowania cząstek wirusowych. Komórki HEK293T wymagają podziału co drugi dzień przy użyciu ciepłej pożywki. Nie powinny osiągać 100% konfluencji, aby uzyskać optymalne wyniki. Aby uzyskać dobrą wydajność transfekcji, komórki te muszą być hodowane przez co najmniej tydzień, aby znajdowały się w fazie log. Wydajność transfekcji wynosiła 22%, jak określono na podstawie ekspresji tdTomato w mikroskopie fluorescencyjnym 24 godziny później (Figura 7A-B). Aby wygenerować linię komórkową białaczki mysiej wyrażającą gen tdTomato do badań nad immunoterapią, komórki białaczkowe C1498 transdukowano świeżo zebranym wirusem (36 godzin od transfekcji). Badania obrazowe (Figura 7C) i analiza cytometryczna przepływu (Figura 7D) cztery dni po transdukcji potwierdziły ekspresję tdTomato w większości komórek.
Ocena ekspresji in vitro sklonowanego genu. (A, B) Komórki HEK293T poddano transfekcji plazmidami Gag/Pol, VSVG i tdTomato. Ekspresję genu tdTomato oceniano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Obrazy fluorescencyjne były nakładane na obraz jasnego pola w celu zróżnicowania komórek pozytywnie transdukowanych. Wydajność transfekcji określono na podstawie ekspresji tdTomato po 24 godzinach. Nietransfekowane komórki HEK293T wykorzystano jako kontrole (niebieski histogram). (C, D) Linia komórkowa białaczki mysiej C1498 została transfekowana świeżym wirusem. Cztery dni później, ekspresję transgenu oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (C) i cytometrii przepływowej (D). Komórki C1498 nie transdukowane były używane jako kontrole (niebieski histogram). Paski skali przedstawiają 30 μm.
.
Dodaj komentarz