Isolation of Extended-Spectrum β-lactamase- (ESBL-) Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from Patients with Community-Onset Urinary Tract Infections in Jimma University Specialized Hospital, Southwest Ethiopia

Abstract

Background. Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli to główne organizmy wytwarzające β-laktamazy o rozszerzonym spektrum (ESBL-), coraz częściej izolowane jako przyczyny powikłanych zakażeń układu moczowego, które pozostają ważną przyczyną niepowodzenia terapii cefalosporynami i mają poważne konsekwencje dla kontroli zakażeń. Cel pracy. Ocena częstości występowania i wzorów oporności na antybiotyki Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae wytwarzających ESBL z zakażeń układu moczowego wywołanych przez społeczność w szpitalu specjalistycznym Uniwersytetu Jimma, południowo-zachodnia Etiopia, 2016 r. Metodologia. Przeprowadzono szpitalne badanie przekrojowe, a łącznie 342 próbki moczu wyhodowano na agarze MacConkey w celu wykrycia czynników etiologicznych. Do wykrywania szczepów wytwarzających ESBL zastosowano metodę synergii podwójnych krążków (DDS). Krążek amoksycyliny + kwasu klawulanowego (20/10 µg) umieszczano na środku płytki agarowej Mueller-Hinton, a cefotaksym (30 µg) i ceftazydym (30 µg) umieszczano w odległości 20 mm (od środka do środka) od krążka amoksycyliny + kwasu klawulanowego. Zwiększoną strefę zahamowania wzrostu któregokolwiek z krążków cefalosporyn po stronie przeciwnej do krążka amoksycylina + kwas klawulanowy uznawano za producenta ESBL. Wyniki. W obecnym badaniu fenotypy wytwarzające ESBL wykryto u 23% (n = 17) izolatów z układu moczowego, z czego Escherichia coli stanowiła 76,5% (n = 13), a K. pneumoniae 23,5% (n = 4). Fenotypy wytwarzające ESBL wykazywały wysoką oporność na cefotaksym (100%), ceftriakson (100%) i ceftazydym (70,6%), natomiast zarówno izolaty wytwarzające ESBL, jak i nie wytwarzające ESBL wykazywały niską oporność na amikacynę (9,5%), nie obserwowano oporności na imipenem. W analizie czynników ryzyka stwierdzono, że wcześniejsze stosowanie antybiotyków więcej niż dwa cykle w ciągu ostatniego roku (iloraz szans (OR), 6,238; 95% przedział ufności (CI), 1,257-30,957; p = 0,025) oraz nawracające UTI więcej niż dwa cykle w ciągu ostatnich 6 miesięcy lub więcej niż trzy cykle w ciągu ostatniego roku (OR, 7,356; 95% CI, 1,429-37,867; p = 0,017) były istotnie związane z grupami produkującymi ESBL. Wnioski. W izolatach z dróg moczowych wykryto szczepy wytwarzające β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania (ESBL-). Wśród producentów ESBL częściej występuje wielolekowa oporność na cefalosporyny III generacji, aminoglikozydy, fluorochinolony, trimetoprim-sulfametoksazol i tetracykliny. Dlatego wykrywanie i zgłaszanie organizmów wytwarzających ESBL ma ogromne znaczenie w podejmowaniu decyzji klinicznych.

1. Wprowadzenie

Drobnoustroje lekooporne wszelkiego rodzaju mogą przemieszczać się wśród ludzi i zwierząt, z jednego kraju do drugiego bez uprzedzenia. Od XXI wieku uważa się, że pojawienie się bakterii wytwarzających β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania (ESBL-) może stanowić rosnące ryzyko przenoszenia opornych szczepów u ludzi i zwierząt. Jest to niepokojący problem zdrowia publicznego na świecie, ponieważ zakażenia wywołane przez takie organizmy wytwarzające enzymy wiążą się z wyższą zachorowalnością i śmiertelnością oraz większym obciążeniem fiskalnym. Problem ten jest wyraźnie poważny w krajach rozwijających się, gdzie badania na ten temat, dostępność leków i ich właściwe stosowanie były ograniczone, a wskaźnik oporności wysoki .

Organizmy wytwarzające ESBL są zdolne do hydrolizy penicylin, cefalosporyn o szerokim spektrum działania i monobaktamów, ale nie działają na cefamycyny i karbapenemy, a ich aktywność jest hamowana przez kwas klawulanowy. Ponadto, organizmy wytwarzające ESBL często wykazują oporność na inne klasy leków przeciwbakteryjnych, takie jak fluorochinolony, aminoglikozydy i trimetoprim-sulfametoksazol, ze względu na związane z nimi mechanizmy oporności, które mogą być kodowane chromosomalnie lub plazmidowo. Powszechne stosowanie cefalosporyn trzeciej generacji było uważane za główną przyczynę mutacji w tych enzymach, co doprowadziło do pojawienia się ESBL kodowanych plazmidowo. Te ESBL były przenoszone między bakteriami przez plazmidy, które z kolei były rozprzestrzeniane przez dystrybucję klonalną między szpitalami i krajami poprzez mobilność pacjentów .

Obecność ESBL komplikuje wybór antybiotyków, szczególnie u pacjentów z poważnymi infekcjami, takimi jak bakteriemia. Powodem tego jest fakt, że bakterie wytwarzające ESBL, również te pochodzące ze społeczności, są często wielooporne na różne antybiotyki; interesującą cechą izolatów wytwarzających CTX-M (CTX oznacza cefotaksymazę, a M – monachium) jest współoporność na fluorochinolony. Typ CTX-M ESBL został opisany jako enzym preferencyjnie hydrolizujący cefotaksym w stosunku do ceftazydymu, a także hydrolizujący cefepim z wysoką wydajnością .

Rozprzestrzenianie się i obciążenie bakteriami wytwarzającymi ESBL są większe w krajach rozwijających się. Wyniki niedawnego przeglądu wykazały, że łączna częstość występowania zakażeń związanych z opieką zdrowotną w warunkach ograniczonych zasobów (15,5%) była dwukrotnie wyższa niż średnia częstość występowania w Europie (7,1%). Niektóre prawdopodobne przyczyny tej różnicy obejmują następujące warunki, które są powszechne w krajach o niskich dochodach: zatłoczone szpitale, szersze samoleczenie i stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych bez recepty, gorsza higiena w ogóle, a zwłaszcza w szpitalach, i mniej skuteczna kontrola zakażeń .

W porównaniu z resztą świata, ogólnie brakuje kompleksowych danych dotyczących Enterobacteriaceae wytwarzających ESBL w krajach afrykańskich. Rzeczywista sytuacja w zakresie antybiotykooporności również nie jest jasna, ponieważ organizmy wytwarzające ESBL, jak również nie będące producentami ESBL, nie są rutynowo hodowane i ich oporność na antybiotyki nie może być badana. Dlatego też badanie to zostało przeprowadzone w celu określenia częstości występowania i wzoru oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae produkujących ESBL, wyizolowanych od pacjentów z UTI wywołanym przez społeczność w Szpitalu Specjalistycznym Uniwersytetu Jimma w południowo-zachodniej Etiopii.

2. Materiały i metody

2.1. Obszar badania i okres

Badanie przeprowadzono w Jimma University Specialized Hospital (JUSH) w mieście Jimma od marca do czerwca 2016 roku. Szpital specjalistyczny Uniwersytetu Jimma znajduje się na południowy zachód od Addis Abeby, stolicy Etiopii, i obecnie jest jedynym ponad 300-łóżkowym szpitalem dydaktycznym w południowo-zachodniej części kraju.

2.2. Study Design and Study Participants

Badanie przekrojowe przeprowadzono w celu oceny częstości występowania i wzoru oporności przeciwdrobnoustrojowej E. coli i K. pneumoniae wytwarzających ESBL wśród zakażeń UTI wywołanych przez społeczność w specjalistycznym szpitalu Uniwersytetu Jimma (JUSH) w południowo-zachodniej Etiopii. Uczestnikami badania byli wszyscy pacjenci ambulatoryjni w wieku ≥15 lat, u których podejrzewano objawy zakażenia dróg moczowych rozpoznane klinicznie w ciągu 48 godzin od przyjęcia oraz pacjenci zgłaszający się z oddziałów ambulatoryjnych w celu wykonania diagnostyki laboratoryjnej moczu. Przed zebraniem danych uzyskano od pacjentów lub ich opiekunów pisemną, świadomą zgodę na udział w badaniu. Pacjenci, u których podejrzewano objawy UTI, byli identyfikowani poprzez komunikację z lekarzem, który na formularzach zleceń laboratoryjnych umieszczał słowo „UTI” jako numer identyfikacyjny dla tych pacjentów, u których podejrzewano UTI zgodnie z rozpoznaniem klinicznym i zgłaszali się do laboratorium w celu wykonania badania moczu. Pacjenci, którzy otrzymali antybiotyki w ciągu ostatnich 2 tygodni zostali wykluczeni.

2.3. Definicje

Infekcje wywołane przez społeczność są definiowane jako infekcje, których początek wystąpił w ciągu 48 godzin od przyjęcia do szpitala lub które pojawiły się w warunkach ambulatoryjnych. Takie infekcje można podzielić na dwie grupy. Pierwsza grupa jest związana z instytucjami opieki zdrowotnej i obejmuje pacjentów otrzymujących leczenie dożylne lub specjalistyczną opiekę, tych, którzy otrzymali leczenie hemodializą lub chemioterapię przeciwnowotworową, tych, którzy uczestniczyli w jakiejkolwiek klinice szpitalnej w ciągu poprzednich 30 dni, tych, którzy zostali przyjęci do ośrodka ostrej opieki dwa dni w ciągu poprzednich 90 dni oraz mieszkańców domów opieki lub ośrodków opieki długoterminowej. Druga grupa reprezentuje prawdziwe zakażenia nabyte przez społeczność u pacjentów, którzy nie spełniają wyżej wymienionych kryteriów.

2.4. Gromadzenie danych

2.4.1. Dane socjodemograficzne i kliniczne

Dane socjodemograficzne i inne dane kliniczne, takie jak wiek, płeć, wcześniejsze stosowanie antybiotyków więcej niż dwa cykle w ciągu roku, wcześniejsze leczenie dożylne w domu lub jakichkolwiek klinikach oraz wielokrotne wizyty ambulatoryjne w szpitalu w ciągu ostatnich 30 dni, wcześniejsza hospitalizacja w ośrodku ostrej opieki 2 lub więcej dni w ciągu 90 dni, poprzednie zabiegi inwazyjne w obrębie układu moczowego, poprzednia pielęgnacja ran przez wyspecjalizowaną opiekę pielęgniarską lub rodzinę w ciągu 30 dni, obecność cukrzycy i nawracające zakażenia układu moczowego zostały zebrane w drodze bezpośredniego wywiadu z pacjentem lub opiekunem pacjenta przy użyciu dobrze skonstruowanego kwestionariusza przed pobraniem próbek laboratoryjnych.

2.4.2. Zbieranie danych laboratoryjnych

W sumie 342 próbki moczu pobrano za pomocą sterylnych, szerokich i szczelnych pojemników. Dobrze wymieszaną próbkę moczu o objętości 10 µl (0,01 ml) inokulowano na agar MacConkey (Oxoid, UK) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Liczbę kolonii wynoszącą co najmniej 105 CFU/ml w pojedynczym moczu środkowym uznawano za dodatnią hodowlę moczu, jak opisano wcześniej. Wszystkie izolaty zostały wstępnie przebadane pod względem morfologii kolonii, wytwarzania barwnika (różowe do bezbarwnych płaskie lub śluzowate kolonie) oraz technik barwienia metodą Grama (Gram-ujemne prątki, nieporowate i niekapsułkowate). Dalsza identyfikacja izolatów była dokonywana na podstawie zgodności ruchliwości i innych odpowiednich testów biochemicznych. Na przykład, izolat uznawano za E. coli, gdy był indolowy (ciemnoróżowy pierścień) i metylo-czerwony dodatni, cytrynianowy ujemny (bez zmian lub pozostał zielony) i mocznikowy ujemny, był producentem gazu i kwasu oraz był ruchliwy, a za K. pneumoniae uznawano go, gdy był indolowy i metylo-czerwony ujemny, cytrynianowy dodatni, wolno wytwarzał mocznik i nie był ruchliwy. W przypadku opóźnienia, wyizolowane bakterie przechowywano w temperaturze 2-8°C w bulionie odżywczym przez nie więcej niż 24 godziny do czasu wykonania testu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.

2.5. Metody wykrywania ESBL

ESBL-produkujące E. coli i K. pneumonia były najpierw przesiewane w kierunku produkcji ESBL metodą fenotypową, a następnie zostaną potwierdzone fenotypowym testem potwierdzającym zgodnie z wytycznymi Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) z 2014 roku .

2.5.1. Fenotypowe badanie przesiewowe w kierunku wytwarzania ESBL

Test przesiewowy ESBL przeprowadzono standardową metodą dyfuzyjno-krążkową z użyciem ceftazydymu (30 µg), cefotaksymu (30 µg) i ceftriaksonu (30 µg) (Oxoid, UK). Do badań przesiewowych stosowano więcej niż jeden krążek antybiotyku, aby poprawić czułość wykrywania ESBLs, zgodnie z zaleceniami wytycznych CLSI z 2014 r. . Świeżo wyhodowane kolonie zawieszano w normalnym roztworze soli fizjologicznej, a mętność zawiesiny korygowano na 0,5 wzorca McFarlanda. Zawiesinę tę inokulowano na agar Mueller-Hinton (Oxoid, UK) za pomocą sterylnych wacików, a następnie wszystkie powyższe trzy krążki z antybiotykami umieszczano w odstępie 20 mm i inkubowano w temperaturze 35 ± 2°C przez 16-18 godzin. Izolaty o obniżonej wrażliwości na cefotaksym (średnica strefy ≤27 mm), ceftazydym (średnica strefy ≤22 mm) i ceftriakson (średnica strefy ≤25 mm) wokół krążków podejrzewano jako producentów ESBLs

2.5.2. Potwierdzenie fenotypowe producentów ESBL

Potwierdzenie podejrzanych producentów ESBLs przeprowadzono metodą aproksymacji podwójnej tarczy lub synergii podwójnej tarczy (DDS) na agarze Mueller-Hinton, zgodnie z zaleceniami wytycznych CLSI z 2014 roku . Krążek amoksycyliny + kwasu klawulanowego (20/10 µg) umieszczano na środku płytki Mueller-Hinton Agar, a następnie cefotaksym (30 µg) i ceftazydym (30 µg) umieszczano w odległości 20 mm (środek do środka) od krążka amoksycyliny + kwasu klawulanowego na tej samej płytce. Płytkę inkubowano w temperaturze 37oC przez 24 godziny i badano pod kątem wzmocnienia lub rozszerzenia strefy zahamowania oksyimino-β-laktamu spowodowanego synergią klawulanianu w krążku amoksycyliny z kwasem klawulanowym, co interpretowano jako wynik pozytywny dla wytwarzania ESBL.

2.6. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe

Oznaczenie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe wykonano techniką dyfuzyjno-krążkową Kirby-Bauera na agarze Mueller-Hinton zgodnie z wytycznymi CLSI 2014 dla następujących krążków przeciwdrobnoustrojowych: amoksycylina/kwas klawulanowy (20/10 µg), cefotaksym (30 µg), ceftriakson (30 µg), ceftazydym (30 µ g), ampicylina (10 µg), cefalotyna (30 µg), ciprofloksacyna (5 µg), kwas nalidyksowy (30 µg), norfloksacyna (10 µg), gentamycyna (10 µg), amikacyna (30 µg), tetracyklina (30 µg), trimetoprim-sulfametoksazol (1.25/23,75 µg), imipenem (30 µg) i chloramfenikol (30 µg) (Oxoid; UK). Wybór środków przeciwbakteryjnych zależał od dostępności i zaleceń CLSI 2014 . Po całonocnej inkubacji płytki agarowej Mueller-Hinton z krążkami przeciwdrobnoustrojowymi w temperaturze 37°C, strefę zahamowania mierzono za pomocą linijki i interpretowano poprzez porównanie z wykresem Kirby-Bauera. Szczepy kontrolne (K. pneumoniae ATCC 700603 i Escherichia coli ATCC 25922) były używane do monitorowania jakości krążków antybiotykowych podczas badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe i podczas metod wykrywania ESBL.

Oporność wielolekowa (MDR) jest definiowana jako oporność na trzy lub więcej klas antybiotyków .

2.7. Analiza danych

Dane zostały przeanalizowane przy użyciu programu SPSS w wersji 16.0. Różnice w zmiennych kategorycznych i schemacie lekowrażliwości pomiędzy grupami produkującymi ESBL i nieprodukującymi tej substancji analizowano statystycznie za pomocą testu chi kwadrat (dokładnego Fishera). Obliczono współczynniki szans (OR) i ich 95% przedziały ufności (CI), a wartość 0,05 uznano za istotną statystycznie. Wyniki badań przedstawiono w tabelach.

3. Wyniki

3.1. Próbki kliniczne i uzyskane izolaty

W obecnym badaniu, w około 74 (21,6%) próbkach moczu potwierdzono dodatni posiew moczu, z czego 63 (85,1%) stanowiły E. coli, a 11 (14,9%) K. pneumoniae. Spośród 74 dodatnich posiewów moczu, u 17 (23,0%) potwierdzono dodatni wynik w kierunku produkcji ESBL. E. coli stanowiła znaczną liczbę izolatów z moczu, jak również wyższy odsetek bakterii wytwarzających ESBL (13 (76,5%)) niż K. pneumoniae (4 (23,5%)). Najwięcej izolatów bakterii i wyższy odsetek szczepów wytwarzających ESBL wyizolowano od kobiet (12 (70,6%)) niż od mężczyzn (5 (29,4%)). Średni wiek pacjentów, u których wykryto producentów ESBL wynosił 35,07 lat (±13,30 SD). Spośród wszystkich producentów ESBL, 9 (52.9%) były izolowane od pacjentów w wieku powyżej 50 lat (Tabela 1).