Metody, techniki i protokoły immunocytochemii

Strona głównaICC >Utrwalanie komórek

Aby zapewnić swobodny dostęp przeciwciała do jego antygenu, komórki muszą być utrwalone i permeabilizowane. Ogólnie rzecz biorąc, siły i czasy utrwalania są znacznie krótsze w przypadku komórek niż w przypadku grubszych, strukturalnie złożonych fragmentów tkanek. W przypadku immunocytochemii przygotowanie próbki polega głównie na przymocowaniu komórek docelowych do szkiełka. Idealne utrwalenie unieruchomiłoby antygeny, zachowując jednocześnie autentyczną architekturę komórkową i subkomórkową oraz umożliwiając niezakłócony dostęp przeciwciał do wszystkich komórek i przedziałów subkomórkowych. Powszechnie stosuje się szeroką gamę środków utrwalających, a właściwy wybór metody zależy od natury badanego antygenu i właściwości stosowanego przeciwciała. Metody utrwalania dzielą się ogólnie na dwie klasy: rozpuszczalniki organiczne i odczynniki sieciujące. Rozpuszczalniki organiczne, takie jak alkohole i aceton, usuwają lipidy i odwadniają komórki, jednocześnie wytrącając białka z architektury komórkowej. Odczynniki sieciujące (takie jak paraformaldehyd) tworzą mostki międzycząsteczkowe, zwykle poprzez wolne grupy aminowe, tworząc w ten sposób sieć połączonych antygenów. Odczynniki sieciujące zachowują strukturę komórek lepiej niż rozpuszczalniki organiczne, ale mogą zmniejszać antygenowość niektórych składników komórek i wymagają dodania etapu permeabilizacji, aby umożliwić dostęp przeciwciał do próbki. Utrwalanie obydwiema metodami może denaturować antygeny białkowe i z tego powodu przeciwciała przygotowane przeciwko zdenaturowanym białkom mogą być bardziej przydatne do barwienia komórek. Opisane są różne metody utrwalania. Właściwa metoda utrwalania powinna być wybrana zgodnie z odpowiednim zastosowaniem.

1. Utrwalanie acetonem

  • Utrwalać komórki w -20°C acetonem przez 5-10 minut.

  • Po utrwaleniu acetonem nie jest wymagany etap permeabilizacji.

2. Utrwalanie metanolem

  • Utrwalać komórki w -20°C metanolem przez 5-10 minut.

  • Nie jest wymagany etap permeabilizacji po utrwalaniu metanolem.

3. Utrwalanie etanolem

  • Utrwalić komórki w schłodzonym 95% etanolu, 5% lodowatym kwasie octowym przez 5-10 minut.

4. utrwalanie metanolowo-acetonowe

  • Utrwalić w schłodzonym metanolu, 10 minut w temperaturze -20 °C.

  • Usunąć nadmiar metanolu.

  • Permeabilizować schłodzonym acetonem przez 1 minutę w temperaturze -20 °C.

5. Metanol-Aceton Mix Fixation

  • Mieszanina metanolu i acetonu w stosunku 1:1.

  • Przygotować świeżą mieszaninę i utrwalić komórki w temperaturze -20 C przez 5-10 minut.

6. utrwalanie mieszaniną metanolu i etanolu

  • 1:1 mieszanina metanolu i etanolu.

  • Mieszaninę przygotować na świeżo i utrwalić komórki w temperaturze -20 C przez 5-10 minut.

7. utrwalanie formaliną

  • Utrwalić komórki w 10% obojętnej zbuforowanej formalinie przez 5-10 minut.

  • Przepłukać krótko PBS.

  • Permeabilizować za pomocą 0,5% Triton X-100 przez 10 minut.

8. Utrwalanie paraformaldehydem-Triton

  • Utrwalić w 3-4% paraformaldehydzie przez 10-20 minut.

  • Przepłukać krótko PBS.

  • Permeabilizować 0,5% Tritonem X-100 przez 10 minut.

9. Utrwalanie paraformaldehydem-metanolem

  • Utrwalać w 4% paraformaldehydzie przez 10-20 minut.

  • Przepłukać krótko PBS.

  • Permeabilizować schłodzonym metanolem przez 5-10 minut w temperaturze -20 °C.

.