Results and Discussion

Overall TE Domain Structure. Chociaż struktura wyizolowanej domeny TE, która została rozwiązana, reprezentuje dwie niezależne cząsteczki (1 i 2) w jednostce asymetrycznej (Tabela 1), domena została oczyszczona i w pełni aktywna jako monomer (Z.G. i B.C., dane niepublikowane). Natywny ludzki FAS jest ułożony jako antyrównoległy homodimer typu głowa-ogon (1), co zostało ostatnio uwidocznione na mapach krio-mikroskopii elektronowej (cryo-EM) (31). Takie ułożenie spowodowałoby umieszczenie dwóch domen TE monomerów FAS na przeciwległych końcach, co nie ma żadnego znaczenia funkcjonalnego dla tworzenia dimeru. Z tych powodów dimer jest artefaktem krystalizacji. Struktura cząsteczki 1 jest uważana dalej za reprezentatywną strukturę.

Domena TE ludzkiego FAS składa się z dwóch subdomen (A i B) (ryc. 1). Większa subdomena A (≈23 kDa) składa się z dwóch nieciągłych segmentów od końca aminowego (lub N-) i karboksylowego (lub C-) (Ryc. 1, 2, 3). Segment pośredni jest przypisany do mniejszej (≈9-kDa) subdomeny B. Subdomena A ma ogólny fałd α/β, podczas gdy subdomena B ma motyw całkowicie α-helikalny. Cała struktura składa się z dziewięciu α-heliksów i ośmiu pasm β (Rys. 1 i 2). Większość całej struktury domeny TE dała się dopasować do gęstości elektronowej, z wyjątkiem trzech segmentów i reszty glicynowej przedstawionych na Rys. 1, 2, 3, których brak lub słaba gęstość wskazuje na ich dużą ruchliwość. Wszystkie nieuporządkowane segmenty znajdują się w regionach eksponowanych na działanie rozpuszczalnika i nigdzie nie są zaangażowane w kontakty krystaliczne.

Trzy reszty katalityczne ludzkiego FAS TE (Ser-2308, His-2481 i Asp-2338) są połączone ze sobą i sąsiednimi resztami rozbudowaną siecią wiązań wodorowych (Ryc. 4). Grupa hydroksylowa Ser-2308 jest zaangażowana w kooperatywne wiązanie wodorowe, przyjmując od sąsiedniego szkieletu amidowego Tyr-2309 i donorując do Nε2 His-2481. To z kolei ułatwiłoby aktywację Ser-2308 jako nukleofila i pomogłoby ustabilizować tetraedryczny pośredni oksyanion, który powinien powstać podczas reakcji katalitycznej TE, jak to ma miejsce w hydrolazach serynowych. Reszta His-2481 (Nε2) jest z kolei związana wodorowo z Asp-2338 (Oδ2). Asp-2338 (atom Oδ1) tworzy dodatkowe wiązania wodorowe zarówno z amidem szkieletu Ala-2448, jak i z grupą hydroksylową Tyr-2462. Tyr-2462 jest całkowicie niezmienny, podczas gdy Ala-2448 jest częściowo konserwowana od owadów do ssaków (Rys. 3). Dlatego też interakcje pomiędzy tymi resztami a katalityczną resztą asparaginianową wydają się być istotne dla utrzymania Asp-2338 w określonej pozycji, co dodatkowo wskazuje na istotną rolę tej reszty. Rozległa sieć wiązań wodorowych w miejscu katalitycznym utrzymuje enzym przygotowanym do działania poprzez orientowanie i umieszczanie reszt katalitycznych w ich wymaganych pozycjach, podobnie jak w hydrolazach serynowych (40).

Specyficzność miejsca wiązania łańcucha palmitoilowego i długości łańcucha. Aby uzyskać zrozumienie mechanizmu, za pomocą którego domena TE FAS reguluje specyficzność długości łańcucha, przeanalizowaliśmy strukturę TE pod kątem obecności rowka w pobliżu centrum katalitycznego, który mógłby pomieścić substraty o długim łańcuchu acylowym. Widoczna jest obecność tylko jednego rowka, który znajduje się na interfejsie pomiędzy subdomenami A i B (Rys. 5). Analiza przy użyciu programu proshape (patrz Materiały i Metody) potwierdziła obecność rowka o objętości 186,9 Å3 i powierzchni 140 Å2, którego dystalny koniec tworzy kieszeń (Rys. 5). Rowek ten znajduje się w pobliżu aminowego terminala domeny TE, która jest połączona z domeną ACP FAS, która zatrzymuje rosnące łańcuchy acylowe do skanowania i uwolnienia przez domenę TE po osiągnięciu optymalnej długości 16-węglowego łańcucha kwasu tłuszczowego. Większość reszt wyściełających rowek pochodzi z ampifilowej helisy α8 subdomeny B. Inne reszty przyczyniające się do jego powstania pochodzą z helisy α5 subdomeny B, N-końcowej helisy α1 subdomeny A oraz pętli pomiędzy β2 i α2 subdomeny A. Reszty wyścielające rowek, które w większości mają charakter hydrofobowy, składają się z Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 i Lys-2426 z helisy α8, Phe-2370 i Phe-2371 z helisy α5, Leu-2222, Leu-2223 i Val-2224 z helisy α1 oraz Ile-2250 i Glu-2251 z pętli pomiędzy β2 i α2 (Rys. 5A ). Spośród tych reszt, Ile-2250, Glu-2251 i Lys-2426 są niezmienne gatunkowo, podczas gdy Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 i Phe-2423 są w większości konserwowane (Rys. 3). Pozostałe reszty są całkowicie konserwowane u ssaków (ryc. 3). Wszystkie powyższe obserwacje razem wzięte sugerują, że interfejs pomiędzy tymi dwiema subdomenami jest doskonałym miejscem do wiązania łańcuchów kwasów tłuszczowych. W celu uwiarygodnienia tej sugestii i uzyskania wglądu w selektywność łańcucha acylowego kwasów tłuszczowych przeprowadzono dwa eksperymenty.

Rys. 5.

Miejsce wiązania lipidów. (A) Stereowizualny widok rowka wiążącego palmitoil dla pierwszych 11-12 karbonów i kieszeni dla ostatnich 5-4 karbonów. Inhibitor heksadecylosulfonylowy przedstawiony jest jako model wypełnienia przestrzeni Corey-Pauling-Koltun (C, żółty; O, czerwony; S, zielony). Łańcuchy boczne wyściełające rowek są przedstawione w postaci figur kulistych (C, żółty; O, czerwony; N, niebieski). Łańcuchy boczne tworzące miejsce aktywne są również przedstawione w postaci figur kulistych, a ich kolorystyka jest podobna do kolorystyki reszt. Mapa powierzchni rowka przedstawiona jest w postaci zielonej siatki drucianej. Reszty tworzące rowek są zaznaczone, z wyjątkiem Ile-2250, która nie jest widoczna, ponieważ znajduje się poniżej inhibitora. Początkowe 11-12 atomów węgla z grupy sulfonylowej są odsłonięte przez rozpuszczalnik, a 11. i 12. atom węgla znajdują się w ujściu kieszeni. (B) Inny widok na rowek i kieszeń. Strzałki oznaczają obroty w przejściu od orientacji widoku w A do B. Ten widok pokazuje, że większość łańcucha acylowego tłuszczowego inhibitora heksadecylowego jest wystawiona na działanie rozpuszczalnika.

Po pierwsze, wykazaliśmy przez mutagenezę ukierunkowaną przez miejsce, że zastąpienie kilku reszt wyściełających rowek i kieszeń domeny TE zmniejszyło aktywność TE, chociaż do różnych zakresów (Tabela 2).

Zobacz tę tabelę:

  • View inline
  • View popup

Tabela 2. Mutacje w kandydackim rowku wiążącym zmniejszają aktywność TE

Po drugie, byliśmy w stanie modelować wiązanie inhibitora zawierającego łańcuch palmitoilowy C16 – heksadecylosulfonylowy luorek (HDSF) do rowka. Modelowanie zostało oparte na danych pochodzących ze struktury krystalicznej białka palmitoilowego TE 1 (PPT1) z kowalencyjnie związanym sulfonianem heksadecylu (HDS) (kod PDB ID 1exw; ref. 41) i wzbogacone o minimalizację energii w cns. Podobnie jak TE, miejsce katalityczne PPT1 zawiera konserwowaną triadę katalityczną seryny, histydyny i asparaginianu. Struktura kompleksu PPT1-HDS wykazała tworzenie się wiązania kowalencyjnego pomiędzy atomem siarki HDS a atomem tlenu katalitycznej seryny oraz obecność łańcucha acylo-tłuszczowego w długim, głównie hydrofobowym rowku powierzchniowym białka (41). Modelowany kowalencyjnie związany HDS w strukturze TE (przedstawiony na Rys. 5) ujawnił kilka cech wiązania ligandu o ważnych implikacjach funkcjonalnych i biochemicznych. Dopasowanie HDS nie spowodowało większej rearanżacji reszt w miejscu wiązania. Łańcuch palmitoilowy ulega ostremu wygięciu w stosunku do grupy sulfonianowej w sposób podobny do tego, jaki obserwuje się w strukturze związanego PPT1. Łańcuch palmitoilowy o 16 atomach węgla dobrze mieści się w rowku, przy czym pierwsze ≈12 atomów węgla jest wystawione na działanie rozpuszczalnika, a pozostałe ≈4 atomy węgla są włożone i utrzymywane w miejscu w kieszeni dystalnej. Takie dopasowanie jest w pełni zgodne z obserwacją, że FAS TE ssaków katalizuje powstawanie kwasu palmitynowego jako swojego głównego produktu (20). Obecność ostatnich ≈4 atomów węgla w kieszeni pomaga związać łańcuch kwasu tłuszczowego w miejscu hydrolizy substratu acylu palmitoilowego. Charakter miejsca wiążącego, które łączy odsłonięty rowek z zamkniętą kieszenią, jest unikalny i zaprojektowany z myślą o specyficzności tego TE. Stwierdzenie, że domena TE FAS ssaków nie wykazuje znaczącej aktywności w stosunku do łańcuchów acylowych tłuszczów o długości mniejszej niż 14 atomów węgla (20) można wyjaśnić nieproduktywnym wiązaniem spowodowanym brakiem wiązania i wynikającą z tego większą ruchliwością odsłoniętych krótszych łańcuchów. Ostatnie ≈4 atomy węgla łańcucha palmitoilowego częściowo zajmują kieszeń dystalną, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca, aby pomieścić tylko 2 dodatkowe atomy węgla. Wynik ten jest zgodny z dramatycznym spadkiem aktywności obserwowanym w przypadku modelowych substratów dłuższych niż 18 atomów węgla (20). Nie jest jasne, czy ostatnie ≈4 i ≈6 atomy węgla, odpowiednio, łańcuchów acylowych tłuszczów C16 i C18, zostaną umieszczone we wstępnie uformowanej kieszeni między dwiema subdomenami, jak widać w strukturze formy niezwiązanej, czy też będą związane początkowo z otwartą formą domeny, która następnie przejdzie ruch zginania zawiasowego między subdomenami, aby zamknąć końcowe atomy węgla łańcuchów acylowych tłuszczów i stworzyć produktywną konfigurację regionu miejsca aktywnego.

Dużo wysiłku włożono w krystalizację TE z różnymi analogami długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (np, palmitoyl-CoA, myristoyl-CoA, stearoyl-CoA, kwas palmitynowy, fluorek heksadecylosulfonylowy i kwas palmitynowy), ale nie znaleziono żadnych długotrwałych stabilnych struktur kompleksowych. Większość kompleksów, jak wykazały niezależne testy aktywności enzymatycznej lub wiązania radioaktywnego w roztworze, dysocjowała w ciągu 5 min do 1 h, co czyniło je nieodpowiednimi do krystalizacji lub prób nasączania kryształów.

Cryo-EM Fit of TE Structure. Chociaż 20-Å krio-EM struktura rekonstrukcji ludzkiego dimeru FAS została opisana (31), nie było wskazania biegunowości N- do C-końca podjednostki FAS, z wyjątkiem wcześniejszego wskazania z etykietowania przeciwciał, że domena FAS TE znajdowała się na jednym z końców całej struktury (42). Podjęliśmy próbę wstępnej oceny polarności poprzez ręczne dokowanie mniejszej (32-kDa) struktury domeny TE ludzkiego FAS, która zajmuje C-końcowy koniec podjednostki FAS, i większej (42 kDa) domeny E. coli β-ketoacyl synthase I (lub KSI) (kod PDB ID 1ek4) (43), która jest bliskim homologiem N-końcowej domeny KS ssaków FAS, do każdego końca jednostki monomeru oznaczonego jako głowa i stopa gęstości masy krio-EM (Rys. 6). Struktura TE dobrze pasuje do końcówki podstruktury oznaczonej stopa, natomiast KSI najlepiej pasuje do końcówki podstruktury oznaczonej głowa (Rys. 6). W dimerze FAS domena ACP oddziałuje zarówno z domeną TE tego samego monomeru, jak i z domeną syntazy ketoacylu w przeciwległym monomerze, co prowadzi do powstania dwóch centrów aktywnych na dwóch końcach dimeru. Orientacja domeny TE i homologu domeny KS dla najlepszego dopasowania, odpowiednio w stopie i głowie, uwzględniała zarówno przestrzeń, jak i funkcjonalne oddziaływanie cząsteczki ACP z obydwoma białkami. Gdy struktury zostały zamienione, dopasowanie było znacznie gorsze, z niektórymi częściami KSI wypadającymi poza gęstością i większą objętością nieuwzględnionej gęstości w dopasowaniu TE (Rys. 6).

Rys. 6.

Wstępne dopasowanie TE (zielony ślad szkieletowy) i KSI (ślad bordowy) w gęstości masowej krio-EM o rozdzielczości 20Å. Podstruktury widoczne z gęstości są oznaczone jako Głowa, Tułów i Stopa. Ślad TE najlepiej pasuje do podstruktury oznaczonej Stopa, natomiast ślad szkieletowy KSI najlepiej pasuje do podstruktury oznaczonej Głowa. Najlepsze dopasowanie zarówno dla KSI jak i TE jest zakreślone na czerwono. Ślady szkieletowe TE i KSI na dole gęstości masy wykazują mniej zadowalające dopasowanie odpowiednio w głowie i stopie. Na podstawie wcześniejszych eksperymentów trawienia proteolitycznego nienaruszonego FAS, zidentyfikowano trzy domeny: domenę I, która obejmuje centra enzymatyczne KS-AT/MT-DH i region łącznika; domenę II, która obejmuje region ER-KR-ACP; oraz domenę III, która jest przypisana do TE (1, 2). Podstruktury głowy i tułowia, które są zasadniczo koalescencyjne, mogą odpowiadać domenie I i części domeny II, a stopa może reprezentować resztę domeny II i domeny III.

Wnioski. Główne wnioski, jakie można wyciągnąć ze struktury krystalicznej domeny TE ludzkiego FAS, są następujące. (i) TE składa się z dwóch subdomen, które różnią się wielkością i motywami składania. (ii) Większa subdomena A wykazuje motyw α/β, podczas gdy mniejsza subdomena B jest w całości helikalna. (iii) Subdomena A zawiera katalityczną triadę reszt Ser, Asp i His. (iv) Długi rowek z dystalną kieszenią pomiędzy subdomeną B i częścią subdomeny A stanowi miejsce wiązania łańcucha acylowego. Geometria i charakter tego miejsca są zgodne z wysoką specyficznością TE w stosunku do substratów acylowych C16 do C18. Rowek działa jak linijka, która mierzy właściwą długość substratu. (v) Wstępne dopasowanie TE do nienaruszonej struktury krio-EM ludzkiego FAS sugeruje prawdopodobną biegunowość podjednostek od N do C terminala. Jednakże, mapa krio-EM o wyższej rozdzielczości jest potrzebna do dalszej weryfikacji dopasowania i dogłębnej analizy funkcji FAS.