Materials

Duloxetine (DLX) pure grade was graciously provided as gift samples by Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, India. Hydroksypropylometyloceluloza (HPMC) klasy 100 M, 4CM i 15 M CR zostały hojnie dostarczone przez Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, Indie. Wszystkie inne chemikalia laboratoryjne i odczynniki użyte w badaniu były klasy odczynnika analitycznego. W całym badaniu stosowano wodę podwójnie destylowaną. Glikol polietylenowy 400 został zakupiony od S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, Indie. Wodorofosforan disodowy, dwuwodorofosforan potasu i wodorotlenek sodu zostały zakupione od CDH Ltd., New Delhi, Indie. Etanol, absolutny, otrzymano z Changshu Yangyuan Chemical, Chiny. n-Oktanol zakupiono z E-Merck (Indie) Ltd., Mumbai, Indie. Membrana dializacyjna150 została zakupiona od Hi Media Laboratories Ltd., Mumbai. Wszystkie materiały i proszki były przechowywane w próżni w temperaturze pokojowej.

Sprzęt

Widma UV były rejestrowane na spektrofotometrze Perkin Elmer lambda 15 UV/visible w zakresie UV/visible od 190 do 600 nm. Cela dyfuzyjna Franza została dostarczona przez firmę Permegear, Inc, USA. Spektrofotometr podczerwieni FT-IR-8300 otrzymano z firmy Perkin Elmer PE RX 1 FTIR spectrophotometer. Widma różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) uzyskano przy użyciu aparatu DSC model Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Wirówka badawcza pochodziła z firmy REMI Equipments, Mumbai, Indie. pH-metr CyberScan pH 510 pochodził z firmy Eutech Instruments, Indie.

Badania preformulacyjne

Przygotowanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami pH 7.4

0,19 g dwuwodorofosforanu potasu, 2,38 g wodoroortofosforanu disodowego i 8,0 g NaCl rozpuszczono w wodzie destylowanej, a objętość uzupełniono wodą destylowaną do 1000 ml. pH buforu dostosowano do 7,4.

Kwantyfikacja chlorowodorku duloksetyny

Zawartość duloksetyny analizowano metodą spektrofotometryczną UV w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami pH 7,4. Skanowanie roztworu podstawowego przeprowadzono w zakresie UV od 190 do 400 nm. Maksimum λ uzyskano przy długości fali 289 nm. Roztwór podstawowy A (250 μ/ml) chlorowodorku duloksetyny sporządzono przez rozpuszczenie 0,0250 g leku w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,4) do objętości 100 ml. Następnie przygotowano seryjne rozcieńczenia od 1 μg/ml do 100 μg/ml duloksetyny przez rozcieńczenie roztworów podstawowych A i B w buforze fosforanowym (pH 7,4). Wartości absorbancji rozcieńczeń zanotowano przy λ max DLX, tj, 289 nm wobec soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,4) pobranej jako ślepa próba, a następnie wykreślono krzywą kalibracyjną.

Charakterystyka fizykochemiczna chlorowodorku duloksetyny

Określenie temperatury topnienia

Niewielką ilość chlorowodorku duloksetyny pobrano do rurki kapilarnej (stopionej na jednym końcu) i umieszczono w aparacie do oznaczania temperatury topnienia, a następnie zarejestrowano temperaturę topnienia. W tym celu wykonano trzy oddzielne pomiary i otrzymano ich średnią wartość.

Oznaczanie współczynnika podziału

Współczynnik podziału chlorowodorku duloksetyny oznaczono w układzie oktanol-woda (Wells 2002). Obie fazy zostały pobrane w stosunku 1:1 v/v i wzajemnie nasycone w wytrząsarce na łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, a następnie obie fazy zostały rozdzielone. Dziesięć miligramów leku dodano do mieszaniny 20 ml wstępnie nasyconej fazy organicznej i 20 ml wstępnie nasyconej wody i wytrząsano przez 10 min. Kolby były następnie przechowywane w temperaturze 37 °C przez 24 godziny z przerywanym wstrząsaniem. Następnie mieszaninę odwirowano, aby oddzielić fazę wodną od niewodnej. Obie fazy były oddzielnie analizowane spektrofotometrycznie na obecność duloksetyny. Następnie obliczano współczynnik podziału leku „K o/w” na podstawie stosunku stężenia leku w oktanolu i w fazie wodnej.

Badania interakcji lek-polimer

Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera

Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) została zastosowana do analizy czystego leku DLX, mieszaniny fizycznej DLX i HPMC (15 CR, 100 M i 4 M) oraz plastrów transdermalnych obciążonych lekiem metodą granulek KBr. Wszystkie próbki skanowano w zakresie od 400 do 4000 cm-1.

Różnicowa kalorymetria skaningowa

Możliwe interakcje pomiędzy lekiem a zastosowanym polimerem analizowano na podstawie termogramów DSC czystego leku – chlorowodorku duloksetyny oraz formulacji (HPMC + lek) uzyskanych przy użyciu aparatu DSC model Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Wszystkie próbki zamknięto w aluminiowych patelniach z płaskim dnem i ogrzewano w zakresie temperatur od 25 do 300 °C z szybkością wzrostu 5 °C/min.

Wytwarzanie plastrów transdermalnych

Filmy transdermalne zawierające chlorowodorek duloksetyny odlewano na szkiełku szklanym metodą odparowania rozpuszczalnika z użyciem różnych gatunków (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) HPMC w obecności i bez plastyfikatora. We wszystkich przypadkach jako plastyfikatora użyto PEG 400 (5%). Tabela 1 przedstawia formuły i skład dla różnych rodzajów plastrów recepturowych. Chlorowodorek duloksetyny (60 mg) rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczalników woda-metanol (7:3). Matrycę leku przygotowano przez rozpuszczenie HPMC o różnym stężeniu (1% i 1,5% w/v) w tym samym rozpuszczalniku. Roztwór utrzymywano w stanie niezakłóconym przez 24 h. Następnie, za pomocą strzykawki i igły, roztwór wlewano do szklanego pierścienia o średnicy 5,0 cm umieszczonego na szklanej powierzchni. Rozpuszczalnik odparowywano przez 6 h w piecu z regulacją termostatyczną w temp. 60 °C. Plastry przechowywano w hermetycznym pojemniku w warunkach otoczenia przez 7 dni przed użyciem.

Tabela 1 Wzory i skład sformułowanych systemów transdermalnych duloksetyny HCl

Ocena plastrów transdermalnych

Wygląd fizyczny

Wszystkie przygotowane plastry poddano oględzinom pod kątem koloru, przejrzystości, elastyczności i gładkości.

Grubość plastra

Grubość plastrów obciążonych lekiem mierzono za pomocą mikrometru śrubowego w trzech różnych punktach plastrów. Wartości średnie i wartości odchylenia standardowego z trzech odczytów obliczono dla każdego plastra obciążonego lekiem.

Jednorodność masy

Plastry poddano badaniu zmienności masy poprzez zważenie wszystkich plastrów na cyfrowej maszynie ważącej. Oznaczenia przeprowadzono w trzech egzemplarzach dla każdej formulacji. Następnie obliczono średnią masę i wartości odchylenia standardowego.

Badanie płaskości

Badanie płaskości przeprowadzono w celu oceny, czy przygotowane plastry transdermalne mają gładką powierzchnię i nie zwężają się z czasem. Z folii wycięto trzy podłużne paski w trzech różnych miejscach. Zmierzono długość każdego paska i określono zmianę długości spowodowaną niejednorodnością płaskości poprzez wyznaczenie procentowego zwężenia, przy czym 0% zwężenia odpowiada 100% płaskości. Procent zwężenia otrzymano jako (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Tutaj, l 1 to początkowa długość każdego paska, a l 2 to końcowa długość każdego paska.

Wytrzymałość na składanie

Test ten przeprowadzono w celu sprawdzenia skuteczności plastyfikatora i wytrzymałości łatki przygotowanej przy użyciu różnych polimerów. Wytrzymałość na składanie definiowana jest jako liczba fałd wymaganych do zerwania łaty polimerowej. Wytrzymałość na składanie mierzono ręcznie poprzez wielokrotne składanie małego paska folii (2 × 2 cm) w tym samym miejscu aż do jego zerwania. Liczba przypadków, w których płat mógł być złożony w tym samym miejscu bez pęknięcia/pęknięcia, dawała wartość wytrzymałości na składanie. Do testu pobrano po trzy łatki z każdego rodzaju.

Procentowa absorpcja wilgoci/absorpcja pary wodnej

Test procentowej absorpcji wilgoci przeprowadzono w celu sprawdzenia fizycznej stabilności i integralności folii w warunkach wysokiej wilgotności. Przygotowane folie (3,14 cm2) ważono pojedynczo i poddawano działaniu 85 ± 5% wilgotności względnej w eksykatorze zawierającym 100 ml nasyconego roztworu chlorku potasu w temperaturze pokojowej. W tym czasie folie były ważone w regularnych odstępach czasu 24, 48 i 72 h. Procentową absorpcję wilgoci określano z następującego wzoru:

Procentowa zawartość wilgoci

Test ten przeprowadzono również w celu sprawdzenia integralności folii w warunkach suchych. Pojedyncze folie transdermalne (o określonej powierzchni) przechowywano w eksykatorze zawierającym stopiony bezwodny chlorek wapnia w temperaturze pokojowej. W tym okresie folie ważono w regularnych odstępach czasu 24, 48 i 72 h. Procentową zawartość wilgoci określano za pomocą następującego wzoru:

Przepuszczalność pary wodnej

Przepuszczalność pary wodnej (WVTR) definiuje się jako ilość wilgoci przepuszczanej przez jednostkę powierzchni folii w jednostce czasu. Jako kuwety transmisyjne zastosowano szklane fiolki o jednakowej objętości i średnicy. Komórki zostały odpowiednio umyte i wysuszone w piecu. Następnie w każdej fiolce umieszczono około 1 g bezwodnego stopionego chlorku wapnia, a łatę przymocowano do brzegu fiolki za pomocą taśmy klejącej. Fiolki te następnie ważono i umieszczano w eksykatorach zawierających nasycony roztwór chlorku potasu w celu utrzymania wilgotności względnej na poziomie 84%. Komórki wyjęto z eksykatorów i zważono po 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 dniu. Szybkość transmisji pary wodnej określono w następujący sposób:

$$ W.= WL/S $$

Gdzie W jest masą transmitowanej pary wodnej, L jest grubością łaty, a S jest powierzchnią odsłoniętą w centymetrze kwadratowym.

Powierzchniowe pH

Płatki utrzymywano w kontakcie z 0,5 ml wody podwójnie destylowanej przez 1 h w szklanych probówkach i pozwalano im spęcznieć. Połączoną elektrodę szklaną przyłożono do powierzchni plastra i dokonano odczytów pH po upływie 1 min.

Oznaczanie zawartości leku

Z każdego rodzaju preparatu wycięto kawałki o wymiarach 2 × 2 i umieszczono je w 100 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7,4. Zawartość mieszano magnetycznie przez 2 h. Następnie roztwór przefiltrowano przez bibułę filtracyjną Whatmana (0,45 μ) i odpowiednio rozcieńczono solą fizjologiczną buforowaną fosforanami pH 7,4. Następnie roztwór analizowano pod kątem absorbancji przy długości fali 289 nm, używając placebo jako próby ślepej. Na podstawie wartości absorbancji określano zawartość leku.

Uwalnianie leków in vitro

Komórka dyfuzyjna Franza została zastosowana do charakterystyki in vitro preparatów transdermalnych. Jest to wiarygodna metoda prognozowania transportu leków przez skórę z preparatów stosowanych miejscowo. Komora receptorowa komory dyfuzyjnej została wypełniona 30,0 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,4), a badania uwalniania leków in vitro przeprowadzono przy użyciu syntetycznej błony celofanowej. Przygotowane preparaty nanoszono na membranę w przedziale donorowym i równomiernie rozprowadzano na membranie celofanowej. Zespół był stale utrzymywany w temperaturze 37,0 ± 2,0 °C przy 50 obr/min. Próbki (podwielokrotności 1.0 ml) były następnie pobierane w odpowiednich odstępach czasu (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 6, 12, i 24 h) i uzupełniane taką ilością pożywki, aby utrzymać objętość fazy receptorowej na poziomie 30 ml. Próbki analizowano spektrofotometrycznie przy długości fali 289 nm.

Badania przenikania leku/ex vivo

Badania przenikania leku przeprowadzono na skórze samców szczurów rasy Wistar. Szczury zostały uśmiercone przez zwichnięcie kręgosłupa. Próbki skóry wycinano, usuwano i przemywano normalnym roztworem soli fizjologicznej. Przylegający tłuszcz i tkankę łączną usuwano za pomocą tępo zakończonych kleszczyków. Skóra była przechowywana w normalnym roztworze soli fizjologicznej przez 6 h. Włosy ze skóry szczura zostały starannie zgolone, aby uniknąć uszkodzeń obwodowych. Przedział receptorowy komórki dyfuzyjnej Franza wypełniono 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,4). Przygotowane preparaty nanoszono na skórę szczura w przedziale donorowym. Temperatura zespołu była stale utrzymywana na poziomie 37 ± 2 °C, a szybkość mieszania kontrolowana na poziomie 50 rpm. Próbki (5 ml podwielokrotności) pobierano w odpowiednich odstępach czasu (0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 24 h) i zastępowano taką samą ilością pożywki, aby utrzymać objętość fazy receptorowej na poziomie 30 ml. Próbki analizowano spektrofotometrycznie przy λ max 289 nm.

Badania podrażnienia skóry

Etyczne zezwolenie na postępowanie ze zwierzętami doświadczalnymi uzyskano od Institutional Animal Ethical Committee (IAEC), Panjab University, Chandigarh, a badania przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonym protokołem.

Szczury albinoskie Wistar trzymano w klatkach, z wolnym dostępem do standardowej diety laboratoryjnej i wody. Grzbietowa skóra brzucha szczurów została starannie ogolona, unikając uszkodzeń obwodowych, przed upływem 24 godzin od przeprowadzenia badania. Na nagą skórę nakładano plaster transdermalny i przykrywano go nieuczulającą taśmą mikroporowatą. Jako standardowy środek drażniący skórę zastosowano 0,8% v/v wodny roztwór formaliny. Zwierzęta otrzymywały nowy plaster każdego dnia do 7 dni. Preparat usuwano po 7 dniach; rejestrowano wynik rumienia i porównywano go ze standardem. Wynik rumienia odczytywano i zapisywano metodą punktową Draize’a (Draize et al. 1944) jako wynik 0 dla braku rumienia, wynik 1 dla bardzo lekkiego rumienia (jasnoróżowy), wynik 2 dla dobrze odgraniczonego rumienia (ciemnoróżowy), wynik 3 dla umiarkowanego do ciężkiego rumienia (jasnoczerwony) i wynik 4 dla ciężkiego rumienia (ciemnoczerwony).

Analiza danych

Dla n-tej próbki, V s jest objętością pobranej próbki, V t jest całkowitą objętością ośrodka receptora, C c jest stężeniem skorygowanym, C u jest stężeniem nieskorygowanym n-tej próbki, a C i jest stężeniem nieskorygowanym. Następnie skorygowane stężenie wykorzystano do obliczenia wartości ilości uwolnionego leku i procentu uwolnionego leku w każdym czasie pobierania próbek wraz z szybkością uwalniania leku.

Współczynnik przepuszczalności to prędkość przejścia leku przez membranę/skórę w μg/cm2/h. Współczynnik przepuszczalności obliczano na podstawie nachylenia wykresu zależności procentu transportowanego leku od czasu, jako P = nachylenie × V d/S

Tutaj, V d jest objętością roztworu dawcy w mililitrach, a S jest powierzchnią tkanki w centymetrach kwadratowych.

Przepływ (wartość J) jest definiowany jako ilość materiału przepływającego przez barierę o jednostkowym przekroju poprzecznym w jednostce czasu. Jest on obliczany przez:

.