Definicja jednostki
Jednostkę aktywności endonukleazy restrykcyjnej definiuje się jako ilość enzymu wymaganą do wytworzenia pełnego trawienia 1 µg substratowego DNA (lub fragmentów) w całkowitej objętości reakcji 50 µl w ciągu 60 minut w optymalnych warunkach analizy, jak podano dla każdej endonukleazy restrykcyjnej.
Określanie aktywności objętościowej endonukleaz restrykcyjnych
Określanie aktywności endonukleaz restrykcyjnych wykonuje się przez dodanie różnych rozcieńczeń enzymu do odpowiedniego buforu testowego zawierającego 1 µg substratu DNA. Po 60-minutowej inkubacji w odpowiedniej temperaturze, trawienie jest przerywane, a próbki DNA są wizualizowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym/bromku etydyny. Najbardziej rozcieńczony roztwór enzymu dający pełne trawienie jest używany do obliczenia aktywności w jednostkach/µl.
Proszę zauważyć, że aktywność jest zależna od substratu i podczas pracy z nowym substratem, enzym powinien być miareczkowany w celu określenia rzeczywistej lub oczekiwanej aktywności.
Kontrole jakości
Wyniki wszystkich testów kontroli jakości są podane w arkuszu danych technicznych dostarczonym z każdym enzymem.
Overdigestion Assay
An overdigestion assay został użyty do jakościowego określenia czystości enzymu i braku niespecyficznych DNaz. W teście overdigestion, do serii probówek zawierających 1 µg substratu DNA dodaje się wzrastające ilości każdej endonukleazy restrykcyjnej (zwykle 10, 20, 30, 40, 50 jednostek). Po 20-godzinnej inkubacji w zalecanych warunkach maksymalna liczba jednostek dająca wyraźny, ostry, normalny wzór prążkowania jest określana za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym/bromku etydyny.
Aby test wypadł pomyślnie, enzym musi dawać niezmieniony wzór prążkowania w warunkach do 600-krotnego przetrawienia (jednostki x godziny) w porównaniu do 2-krotnego trawienia. Jeżeli enzym wykazuje aktywność „gwiazdy” przy mniejszym niż 600-krotnym nadmiarze funkcjonalnym, opis produktu zawiera informacje o nadmiarze funkcjonalnym, przy którym aktywność „gwiazdy” nie występuje.
Assay for Nonspecific Endonucleases
Assay for Nonspecific endonucleases contamination, each restriction endonuclease is incubated with a supercoiled plasmid substrate lacking the recognition sequence of the restriction endonuclease. Pojedynczy niespecyficzny nick w RF I DNA przekształca go w formę RF II (kółko z nickiem). Wzrastające ilości enzymu (zwykle 10, 20, 30, 40, 50 jednostek) dodaje się do serii probówek zawierających 1 µg DNA RF I (forma supercoiled). Po 20-godzinnej inkubacji w zalecanych warunkach, obie formy rozróżnia się na żelach agarozowych i określa się procentową konwersję z RF I do RF II.
Ligation and Recutting Assay
Aby określić funkcjonalną czystość DNA po trawieniu enzymami restrykcyjnymi, zastosowano test ligacji. Substratowe DNA jest całkowicie trawione 10- i 50-krotnym nadmiarem endonukleazy restrykcyjnej w odpowiednim buforze do analizy, ligowane ligazą T4 DNA i ponownie cięte tym samym enzymem restrykcyjnym. Przecięte, podwiązane i ponownie odcięte DNA jest analizowane przez elektroforezę w żelu agarozowym/bromek etydyny. Normalny wzór pasm wskazuje na nienaruszone 5 i 3 termininy, jak również brak zanieczyszczających nukleaz lub fosfataz.
Stabilność
Wszystkie endonukleazy restrykcyjne firmy Jena Bioscience są ponownie testowane co 4-6 miesięcy. Proces ten pozwala nam zapewnić pełną aktywność enzymu i optymalną wydajność każdego dostarczanego enzymu. Ze względu na doskonałe wyniki tych testów, przedłużyliśmy datę ważności większości naszych enzymów do 18 miesięcy.

.