Doxycycline Is Anti-Inflammatory and Inhibits Staphylococcal Exotoxin-Induced Cytokines and Chemokines

Toksyna 1 zespołu wstrząsu gronkowcowego (TSST-1) i strukturalnie pokrewne egzotoksyny są egzotoksynami bakteryjnymi, które wiążą się bezpośrednio z cząsteczkami głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II na komórkach prezentujących antygen (1, 5, 8, 18, 23) i aktywują limfocyty T wyrażające specyficzne elementy Vβ (7). Toksyny te nazywane są superantygenami ze względu na ich zdolność do poliklonalnej stymulacji dużych populacji limfocytów T (1, 4, 7, 14). Egzotoksyny gronkowcowe (SE) są więc silnymi aktywatorami układu immunologicznego i wywołują wiele chorób u ludzi, w tym zatrucia pokarmowe, wstrząs toksyczny i choroby autoimmunologiczne (1, 2, 6, 12, 14, 22). W wyniku ich interakcji z komórkami układu odpornościowego dochodzi do masowej produkcji cytokin i chemokin prozapalnych (1, 4, 15, 17). Cytokiny: czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α), interleukina-1 (IL-1) i interferon gamma (IFN-γ) są kluczowymi mediatorami we wstrząsie toksycznym wywołanym przez superantygen (1, 21). Zarówno TNF-α jak i IL-1 mają silne działanie immunostymulujące i działają synergistycznie z IFN-γ w celu wzmocnienia reakcji immunologicznych i promowania uszkodzenia tkanek (16). W konsekwencji cytokiny te są patogenne w wysokich stężeniach in vivo i odpowiadają za gorączkę i wstrząs toksyczny wywołany przez SE (13, 14, 18, 19).

Doksycyklina jest antybiotykiem o szerokim spektrum działania, szeroko stosowanym w zakażeniach wywołanych zarówno przez drobnoustroje gram-ujemne, jak i gram-dodatnie. Działa bakteriostatycznie i jest wysoce skuteczna wobec wielu mikroorganizmów, w tym Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis i Yersinia pestis. Doksycyklina należy do rodziny antybiotyków tetracyklinowych, której członkowie wykazują inne działania biologiczne, niezależne od ich działania przeciwbakteryjnego (10). Doksycyklina hamuje indukowaną fosforanem-12-myristanu-13-octanu metaloproteinazę macierzy 8 (MMP-8) i MMP-9 w ludzkich komórkach śródbłonka (11). Doksycyklina zmniejsza również degradację elastyny i redukuje aktywność MMP w modelu choroby tętniaków (3). Ostatnio wykazano, że doksycyklina hamuje produkcję IL-1β w hodowlach nabłonka rogówki poddanych działaniu lipopolisacharydu w stopniu porównywalnym do tego, jaki uzyskuje się pod wpływem kortykosteroidów (25). In vivo, doksycyklina chroniła myszy przed śmiertelną endotoksemią poprzez zmniejszenie wydzielania cytokin i azotanów we krwi (20). Badanie to podjęto w celu określenia modulującego wpływu doksycykliny na indukowaną superantygenem gronkowcowym aktywację komórek T i produkcję cytokin z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).

Ludzkie PBMC wyizolowano przez wirowanie gradientu gęstości Ficoll-Hypaque z heparynizowanej krwi od normalnych ludzkich dawców. PBMC (106/ml) hodowano w temperaturze 37°C na płytkach 24-dołkowych zawierających podłoże RPMI 1640 i 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą. Komórki inkubowano z SEB (200 ng/ml) lub TSST-1 (200 ng/ml) przez 16 h, a supernatanty zbierano i analizowano pod kątem IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α i MIP-1β. Cytokiny i chemokiny mierzono metodą immunosorbcji enzymatycznej z przeciwciałami swoistymi dla cytokin i chemokin zgodnie z instrukcjami producenta (15, 17). Ludzkie rekombinowane cytokiny i chemokiny (20 do 1,000 pg/ml) były używane jako standardy do kalibracji na każdej płytce. Granica wykrywalności każdego oznaczenia wynosiła 20 pg/ml. Dane dotyczące cytokin i chemokin zostały wyrażone jako średni odczyt ± odchylenie standardowe (SD) dla zduplikowanych próbek. Doksycyklina, jeśli była obecna, była dodawana jednocześnie z czynnikiem stymulującym. Cytotoksyczność była mierzona przez uwolnienie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) z cytozolu do supernatantu hodowli. LDH oznaczano ilościowo przy użyciu zestawu do kolorymetrycznego oznaczania cytotoksyczności (Boehringer Mannheim) zgodnie z instrukcjami producenta. Maksymalną ilość uwalnianego LDH (100%) uzyskano przez lizę komórek z 1% Triton X-100. Proliferację komórek T badano z PBMC (105/basenik), które umieszczano w trzech powtórzeniach z SEB lub TSST-1 (200 ng/ml), z doksycykliną lub bez, przez 48 h w temperaturze 37°C w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Komórki były pulsowane z 1 μCi tymidyny (New England Nuclear, Boston, Mass.) na studzienkę podczas ostatnich 5 h hodowli, jak opisano wcześniej (15). Komórki zbierano na filtry z włókna szklanego, a wbudowaną tymidynę mierzono metodą scyntylacji cieczowej. Wszystkie dane analizowano pod kątem istotnych różnic za pomocą testu t-Studenta w programie Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Różnice między grupami kontrolnymi leczonymi doksycykliną i nieleczonymi uznano za znaczące, jeśli P było <0,05.

Na podstawie raportu, że doksycyklina blokowała IL-1 indukowaną lipopolisacharydem w komórkach nabłonkowych i zapobiegała śmiertelnej endotoksemii in vivo (20, 25), przetestowaliśmy hipotezę, że ten antybiotyk może mieć bezpośredni wpływ na cytokiny indukowane SE. Jak pokazano na ryc. 1, doksycyklina zależnie od dawki hamowała produkcję cytokin IL-1β, IL-6, TNF-α i IFN-γ oraz chemokin MCP-1, MIP-1α i MIP-1β przez PBMC inkubowane z SEB. Podobną zależną od dawki redukcję cytokin i chemokin przez doksycyklinę obserwowano również w PBMC stymulowanych TSST-1 (dane nie pokazane). Hamujący wpływ doksycykliny na cytokiny i chemokiny stymulowane SEB- lub TSST-1 uzyskane z PBMC od siedmiu prawidłowych dawców podsumowano na ryc. 2. Produkcja MCP-1 i IFN-γ była całkowicie blokowana przez 50 μM doksycykliny. To stężenie doksycykliny redukowało IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α i MIP-1β odpowiednio do 15 do 22%, 37 do 41%, 21 do 25%, 10 do 15% i 59 do 61% w stosunku do komórek nieleczonych, stymulowanych SEB- lub TSST. TNF-β, jeśli był obecny, również został zahamowany do 25% w porównaniu z komórkami nieleczonymi, stymulowanymi SEB. Doksycyklina nie była cytotoksyczna dla PBMC w tym stężeniu, co było mierzone przez wykluczenie błękitu trypanu i brak uwalniania dehydrogenazy mleczanowej z komórek poddanych działaniu substancji. Całkowite zahamowanie tych cytokin i chemokin obserwowano przy wysokich dawkach doksycykliny (>0,1 mM). Podobne hamowanie dawką-odpowiedzią przez doksycyklinę obserwowano przy niższych stężeniach SEB (1 i 10 ng/ml) (dane nie pokazane).

Ponieważ superantygeny powodują również proliferację komórek T, zbadano wpływ doksycykliny na proliferację komórek T indukowaną SE. Figura 3 pokazuje, że doksycyklina hamowała proliferację komórek T stymulowanych SEB- i TSST-1 w sposób zależny od dawki, osiągając 98% inhibicję przy stężeniu 0,05 mM.

Badanie to wykazało, że doksycyklina skutecznie hamowała indukowaną przez superantygen produkcję cytokin i chemokin przez ludzkie PBMC in vitro. Proliferacja komórek T indukowana superantygenami gronkowcowymi była również całkowicie stłumiona. Zmniejszenie stężenia cytokin i chemokin prozapalnych przez doksycyklinę w PBMC stymulowanych SEB- i TSST-1 sugeruje, że doksycyklina może wpływać na patofizjologię wstrząsu toksycznego. Wyniki te rozszerzają obserwacje innych badaczy o immunomodulacyjne działanie doksycykliny oprócz jej aktywności przeciwbakteryjnej.

W wielorakie mechanizmy molekularne, zarówno transkrypcyjne, jak i potranskrypcyjne, mogą być zaangażowane w przeciwzapalne działanie doksycykliny (11, 26). Hamowanie cytokin prozapalnych może wiązać się z wyciszeniem szlaku PKC przez doksycyklinę, jak sugeruje badanie jej wpływu na tworzenie się ziarniniaków (26). Podawana dawka hamująca doksycykliny (10 do 15 μM), która redukuje kolagenazę, żelatynę i inne metaloproteinazy in vitro (10, 11) jest porównywalna z dawką stosowaną w tym badaniu i jest kilkakrotnie wyższa niż dawka obserwowana w surowicy ludzkiej po podaniu doustnym 200 mg dziennie (10, 24). Jednakże badania kliniczne wskazują, że dawka ta była wystarczająca do zmniejszenia aktywności kolagenazy i żelatynazy w ekstraktach z ludzkiej chrząstki kostno-stawowej ex vivo (24). Wykazano, że subantymikrobowa dawka doksycykliny (20 mg dwa razy dziennie) hamuje aktywność kolagenazy w płynie dziąsłowym (9). Ponadto, w badaniach in vivo eksperymentalnej endotoksemii również stwierdzono skuteczność doksycykliny i innych tetracyklin w zmniejszaniu regulacji cytokin zapalnych i zapobieganiu wstrząsowi (20).

Podsumowując, przedstawione tu wyniki wskazują, że doksycyklina zmniejsza regulację cytokin prozapalnych i chemokin, sugerując w ten sposób jej potencjalną przydatność w leczeniu wstrząsu toksycznego wywołanego superantygenem. W warunkach klinicznych, gdy gospodarz jest narażony na działanie wielu czynników biologicznych, w tym zarówno bakterii, jak i egzotoksyn bakteryjnych, stosowanie doksycykliny oferuje dodatkową korzyść polegającą na zapewnieniu zarówno działania przeciwbakteryjnego, jak i przeciwzapalnego.