ARTYKUŁ ORYGINALNY / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNOSIS OF ALPHA-1-ANTITRYPSIN DEFICIENCY BY DNA ANALYSIS OF CHILDREN WITH LIVER DISEASE*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 i Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Background – Alpha-1-antitrypsin deficiency is a genetic disorder which is transmitted in a co-dominant, autosomal form. Niedobór alfa-1-antytrypsyny dotyczy głównie płuc i wątroby, prowadząc w tym drugim przypadku do cholestazy noworodkowej, przewlekłego zapalenia wątroby lub marskości. Dokładne rozpoznanie niedoboru alfa-1-antytrypsyny można postawić na podstawie analizy biochemicznej lub molekularnej. Cel – Celem niniejszej pracy było wykorzystanie analizy DNA do zbadania obecności niedoboru alfa-1-antytrypsyny u 12 dzieci, u których podejrzewano ten niedobór i które wykazywały laboratoryjne i kliniczne cechy choroby. Pacjenci i metody – Badano dwunastu pacjentów w wieku od 3 miesięcy do 19 lat, u których poziom alfa-1-antytrypsyny w surowicy był niższy od normalnego i/lub występowała choroba wątroby o nieokreślonej etiologii. Zmutowane allele S i Z genu alfa-1-antytrypsyny zostały zbadane u 12 dzieci. Organizację genu alfa-1-antytrypsyny analizowano poprzez amplifikację genomu za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy i trawienie enzymami restrykcyjnymi Xmnl (allel S) i Taq 1 (allel Z). Wyniki – Siedmiu z 12 pacjentów miało przewlekłą chorobę wątroby o nieustalonej etiologii, a pozostałych pięciu pacjentów miało niskie stężenie alfa-1-antytrypsyny w surowicy oraz rozpoznanie cholestazy noworodkowej i/lub przewlekłej choroby wątroby o nieustalonej etiologii. Pięciu z 12 pacjentów było homozygotycznych dla allelu Z (ZZ), a dwóch miało allel S z innym allelem (*S) różnym od Z. Wniosek – Uzyskane wyniki wskazują, że niedobór alfa-1-antytrypsyny występuje stosunkowo często u dzieci z przewlekłą chorobą wątroby o nieustalonej etiologii i/lub niskim stężeniem alfa-1-antytrypsyny (41,6%). Prawidłowe rozpoznanie jest ważne dla skutecznej obserwacji klinicznej oraz dla poradnictwa genetycznego.

SZCZEGÓŁY ¾ Niedobór alfa-1-antytrypsyny. Diagnostyka molekularna. Biopsja wątroby.

WPROWADZENIE

Alfa-1-antytrypsyna (A1AT) jest glikoproteiną o masie 52 kDa wytwarzaną głównie przez hepatocyty, które uwalniają 2 g tego białka, na dobę, do krwiobiegu(36). Główną funkcją A1AT jest hamowanie działania elastazy neutrofilowej, proteazy serynowej, która hydrolizuje włókna elastyny w płucach(38). Mutacje w genie kodującym A1AT powodują powstanie białka pozbawionego zdolności hamowania i mogą prowadzić do gromadzenia się A1AT w ciałkach wtrętowych w hepatocytach, obniżając tym samym prawidłowe stężenie tego białka w surowicy(4). Niedobór ten objawia się rozedmą płuc, przewlekłym zapaleniem oskrzeli lub bronchiektazą(9). Nagromadzenie zmutowanego A1AT w hepatocytach może również prowadzić do cholestazy noworodkowej, przewlekłej hepatopatii lub marskości wątroby(33, 34).

Gen A1AT jest wysoce polimorficzny, współdominujący i zlokalizowany na dłuższym ramieniu chromosomu 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Siedemdziesiąt pięć alleli (oznaczonych A-Z zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi) zostało opisanych dla tego genu w oparciu o ogniskowanie izoelektryczne surowicy pomiędzy pH 4 (anoda) i pH 5 (katoda) w żelach poliakrylamidowych. Wspólne warianty migrują do centrum żelu i dlatego należą do rodziny M („środkowej”). Wariant wadliwy, pierwotnie opisany przez LAURELL i ERIKSSON w 1963 roku(21), migruje w kierunku katody i jest określany jako Z. Inny wariant, który porusza się powoli w żelu, jest określany jako S(5). Ten polimorficzny „locus” jest ogólnie znany jako system Pi (inhibitor proteazy). Większość wariantów wytwarza A1AT o prawidłowej ilości i jakości(7, 8, 25). Jednakże niektóre allele, takie jak warianty S i Z, są związane ze stanem niedoboru, który osiąga polimorficzne częstości w populacjach kaukaskich, a także odnotowano przypadki allelu zerowego, w którym produkcja białka jest całkowicie nieobecna(10).

Allel S wynika z substytucji adeniny przez tiaminę w eksonie III genu, co prowadzi do zamiany kwasu glutaminowego w pozycji 264 na walinę i w konsekwencji do powstania niestabilnej struktury białka(10, 11, 19). Allel Z wynika z zastąpienia guaniny w pozycji 342 przez adeninę w eksonie V genu i prowadzi do powstania białka, które gromadzi się na wewnętrznej szorstkiej powierzchni retikulum endoplazmatycznego hepatocytów(6). Diagnozę stanu niedoboru stawia się zwykle po ilościowym oznaczeniu stężenia białka w surowicy wraz z profilem elektroforetycznym po ogniskowaniu izoelektrycznym(23, 37). Bardziej precyzyjna diagnostyka wymaga analizy genów z wykorzystaniem technik opartych na DNA(12, 14, 26).

Celem pracy była identyfikacja nosicieli alleli S i Z u pacjentów, u których podejrzewano ten niedobór i którzy wykazywali laboratoryjne i kliniczne cechy tej choroby.

Pacjenci

W okresie od lutego 1988 roku do sierpnia 1997 roku do Pediatric Gastroenterological Service, State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil, skierowano dużą liczbę pacjentów w celu zbadania chorób wątroby. Z tej liczby tylko u 12 pacjentów nie postawiono jednoznacznej diagnozy (negatywne wyniki wirusowego zapalenia wątroby, autoimmunologicznego zapalenia wątroby i choroby Wilsona). Pacjenci ci zostali poddani analizie molekularnej A1AT.

Metody

1 ¾ Protokół badania

2 – Biopsja wątroby

Przezskórne biopsje wątroby uzyskiwano zgodnie z opisem MOWAT(24) przy zastosowaniu znieczulenia miejscowego u pacjentów pozostających na czczo przez co najmniej 4 h, z żylną glikolizą i prawidłową aktywnością protrombiny. Uzyskany wycinek natychmiast umieszczano w 10% formalinie, a następnie opracowywano i barwiono hematoksyliną-eozyną, trichromem Massona, błękitem pruskim oraz impregnowano srebrem włókna siateczki. Specjalne barwienie uzyskano przy użyciu PAS (periodic acid-Schiff), a następnie poddano działaniu diastazy. Utrzymywanie się ziarnistości cytoplazmatycznych o wyglądzie eozynofili nawet po zastosowaniu diastazy uznano za dodatni wynik dla niedoboru A1AT.

3 – Analiza molekularna

W celu zbadania zmutowanych alleli S i Z A1AT przeprowadzono ekstrakcję DNA z leukocytów krwi obwodowej, stosując metodę opisaną przez WOODHEAD i wsp.(39).

WYNIKI

Pięcioro z 12 badanych dzieci było homozygotami Z (ZZ), natomiast dwoje dzieci posiadało allel S wraz z innym allelem, który nie był allelem Z (*S). W tabeli 1 przedstawiono wiek pacjentów w momencie pobrania krwi oraz wskazania, na podstawie których podjęto decyzję o dalszej analizie. Trzech pacjentów prezentowało cholestazę noworodkową jako początkową manifestację przewlekłej hepatopatii.

W tabeli 2 przedstawiono stężenia ALT, AP, gGT, A1AT w surowicy krwi oraz wyniki badania molekularnego i biopsji wątroby.

Pięciu pacjentów z genotypem ZZ miało obniżone poziomy A1AT w surowicy, a biopsja wątroby wykazała marskość wątroby (jeden), noworodkowe zapalenie wątroby (dwóch), niedostatek międzyzrazikowych dróg żółciowych (jeden) i przewlekłe zapalenie wątroby (jeden). W tym ostatnim przypadku (FSP) w hepatocytach okołoportalowych po barwieniu HE widoczne były ziarnistości cytoplazmatyczne o wyglądzie eozynofilów, potwierdzone następnie pozytywnością PAS i opornością na diastazę (ryc. 1). U dwóch pacjentów z cholestazą noworodkową (EKBA i RHBP) wykonano biopsję wątroby w wieku odpowiednio 10 i 13 tygodni, w której stwierdzono eozynofilowe kuleczki PAS-dodatnie, oporne na diastazę.

Rysunki 2 i 3 przedstawiają wyniki amplifikacji i trawienia odpowiednio alleli S i Z.

DISCUSSION

Niedobór alfa-1-antytrypsyny jest jednym z najczęstszych zaburzeń genetycznych prowadzących do chorób wątroby u dzieci i jest najczęstszą chorobą genetyczną wymagającą przeszczepienia wątroby(17, 28). Niedobór A1AT występuje u 1 na 1600-2000 noworodków w Ameryce Północnej i Europie Północnej(28, 31), ale tylko u 10-15% populacji z tym niedoborem rozwijają się choroby wątroby(32, 33). Według badań opublikowanych przez SVEGER w 1988 roku(33), w okresie noworodkowym u 11% pacjentów z fenotypem PIZZ dochodzi do rozwoju żółtaczki. W badaniu tym u trzech pacjentów, u których rozpoznano niedobór A1AT, wystąpiła cholestaza noworodkowa, a u dwóch z nich, przed ustaleniem ostatecznego rozpoznania niedoboru, cholestazę uznano za idiopatyczną. Pięć do 10 procent przypadków idiopatycznego noworodkowego zapalenia wątroby opisywanych w literaturze jest spowodowanych niedoborem A1AT(3).

U pięciu badanych pacjentów z tym niedoborem stężenie A1AT w surowicy było poniżej dolnej granicy normy. Badanie to nie potwierdziło jednak bezwzględnie rozpoznania choroby. Ponieważ A1AT jest białkiem ostrej fazy zapalnej, jego synteza wzrasta w stanach zapalnych/infekcyjnych, nowotworach, ciąży oraz podczas terapii estrogenami i kortykosteroidami(16, 22). Obniżenie poziomu A1AT w surowicy występuje w zespole udręki oddechowej u noworodków, w terminalnej fazie niewydolności wątroby, w mukowiscydozie oraz w sytuacjach, w których dochodzi do dużej utraty białka(15). Poziomy w surowicy w genotypach SZ, które teoretycznie mogłyby powodować choroby wątroby, są zwykle prawidłowe.

W przypadku cholestazy noworodkowej zasadniczo konieczna jest diagnostyka różnicowa z pozawątrobową atrezją dróg żółciowych. Wywiad kliniczny pozwala na postawienie właściwego rozpoznania w 83% przypadków(1) i konieczne jest wykonanie specyficznych badań w celu zwiększenia dokładności diagnozy. Wśród tych badań największe znaczenie ma biopsja wątroby. Zmiany histopatologiczne widoczne w biopsji wątroby pacjentów z niedoborem A1AT mogą być takie same jak te obserwowane w idiopatycznym noworodkowym zapaleniu wątroby lub w przypadkach atrezji zewnątrzwątrobowych dróg żółciowych(24). Obecność głównie okołoportalowych, wewnątrzhepatocystycznych kulek, które są silnie PAS dodatnie po trawieniu diastazą, jest pomocnym wskaźnikiem niedoboru A1AT(13, 18, 27). Jednak identyfikacja tych globulin przed 12. tygodniem po urodzeniu jest trudna(35). W prezentowanym badaniu u pacjenta EKBA globulki o powyższych cechach występowały w tkance wątroby w wieku 10 tygodni. U pacjenta JCI (13 tydzień życia) nie zaobserwowano takich globulek. Wyniki te sugerują, że obecność kuleczek powinna być badana za pomocą specjalnego barwienia w wycinkach wątroby uzyskanych przed 12 tygodniem życia, chociaż wynik negatywny nie eliminuje możliwości niedoboru A1AT. Analiza biochemiczna nie była stosowana w tym badaniu, ponieważ możliwa była analiza DNA, która jest bardziej precyzyjna.

Niedobór A1AT jest stosunkowo częsty u dzieci z chorobami wątroby o nieustalonej etiologii. Rozpoznanie to jest niedoszacowane, prawdopodobnie dlatego, że stosowane są nieprecyzyjne metody diagnostyczne. Analiza molekularna umożliwia bardziej precyzyjne rozpoznanie i może być również przydatna w poradnictwie genetycznym pacjentów z chorobami wątroby o nieznanej etiologii.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – Deficyt alfa-1-antytrypsyny jest chorobą genetyczną przenoszoną w sposób autosomalny i współdominujący. Do głównych objawów klinicznych należą: powiększenie płuc i wątroby. W tym ostatnim przypadku występuje jako żółtaczka noworodkowa, żółtaczka typu crônica lub marskość wątroby. Ostateczną diagnozę stawia się na podstawie analizy biochemicznej alfa-1-antytrypsyny lub analizy molekularnej. Cel pracy – Zbadanie, w grupie 12 dzieci z podejrzeniem niedoboru alfa-1-antytrypsyny, występowania efetywnej postaci niedoboru za pomocą analizy DNA, w celu postawienia ostatecznej diagnozy, jak również związku między niedoborem alfa-1-antytrypsyny a stwierdzanymi cechami klinicznymi i laboratoryjnymi. Przypadek i metody – Zmutowane allele S i Z genu alfa-1-antytrypsyny były badane u 12 pacjentów w wieku od 3 miesięcy do 19 lat, skierowanych przez Pediatric Gastroenterology Outpatient Clinic of the Universidade Estadual de Campinas, SP, Brazylia, z powodu prezentowania stężenia alfa-1-antytrypsyny w surowicy poniżej normy i/lub choroby wątroby bez określonej etiologii. Analizę DNA przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanej metody amplifikacji genów reakcji łańcuchowej polimerazy, w której utworzono miejsca restrykcyjne dla enzymów Xmnl (allel S) i Taq l (allel Z). Wyniki – Spośród 12 skierowanych pacjentów 7 miało przewlekłą chorobę wątroby o nieustalonej etiologii, a pozostałych 5 miało niskie stężenie alfa-1-antytrypsyny w surowicy z towarzyszącym rozpoznaniem cholestazy noworodkowej i/lub przewlekłej choroby wątroby o nieznanej etiologii. W tej grupie 12 pacjentów zaobserwowano pięciu homozygotycznych pacjentów Z (ZZ) oraz dwóch noszących allel S z towarzyszącym innym allelem, różnym od Z (*S). Wnioski – Uzyskane wyniki wskazują, że niedobór A1AT jest stosunkowo częstym czynnikiem etiologicznym u dzieci z przewlekłą chorobą wątroby o nieustalonej etiologii i/lub niskim stężeniem A1AT w surowicy (41,6%). Znaczenie pewnego rozpoznania tego niedoboru jest uzasadnione nie tylko z punktu widzenia obserwacji klinicznej pacjenta, ale również z punktu widzenia poradnictwa genetycznego.

DESCRITORS ¾ Niedobór alfa-1-antytrypsyny. Diagnostyka molekularna. Biopsja wątroby.

1. Alagille D. Cholestaza w pierwszych trzech miesiącach życia. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Two novel nonradioactive polymerase chain reaction-based assays of dried blood spots, genomic DNA, or whole cells for fast, reliable detection of Z and S mutations in the Alpha-1-antitrypsin gene. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Molekularne podstawy niedoboru alfa-1-antytrypsyny. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. Acumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. Fragmenty restrykcyjne DNA związane z alfa 1-antytrypsyną wskazują na pojedyncze pochodzenie dla allelu niedoboru PI Z. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. The alpha 1-antytrypsin gene and its mutations. Clinical consequences and strategies for therapy. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Alpha-1-antytrypsin deficiency caused by the alpha-1-antitrypsin Nullmattawa gene. An insertion mutation rendering the alpha-1-antitrypsin gene incapapable of producing alpha-1-antitrypsin. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Rapid DNA analysis of alpha 1-antitrypsin deficiency: application of an improved method for amplifying mutated gene sequence. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Histopatologiczne cechy choroby wątroby w niedoborze alfa 1-antytrypsyny. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Denaturing gradient gel electrophoresis of the alpha 1-antitrypsin gene: application to prenatal diagnosis. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Serum enzyme inhibitor concentrations in the respiratory distress syndrome. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Hepatic morphology in inherited metabolic diseases. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Assignment of the alpha 1-antitrypsin gene and a sequence-related gene to human chromossome 14 by molecular hybridization. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. The electrophoretic alpha-1-globulin pattern of serum in alpha-1-antitrypsin deficiency. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Effect of administration of a combined strogen-progestin contraceptive on the level of individual plasma proteins. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alfa 1-antytrypsyna: układ molekularny i układ Pi. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Rapid nonradioactive detection of mutations in the human genome by allele-specific amplification. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Clinical manifestations of alpha 1-antitrypsin deficiency. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identyfikacja molekularna alelos S i Z do genu alfa-1-antytrypsyny w grupie pacjentów z chorobą płuc. Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Niedobór alfa-1-antytrypsyny. High prevalence in the St. Louis area determined by direct population screening. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Liver disease in alpha 1-antitrypsin deficiency detected by screening of 200,000 infants. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. The natural history of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficient children. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Liver disease in infancy. Histological features and relationship to alpha 1-antitrypsin phenotype. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Inhibitory proteazy w ludzkim osoczu. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Niedobór alfa 1-antytrypsyny: przegląd. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Replacement therapy deficiency associated with emphysema. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Badanie przeprowadzone przez Departamenty Pediatrii, Genetyki Medycznej, Patologii Anatomicznej i Patologii Klinicznej Wydziału Nauk Medycznych (FCM), Uniwersytet Stanowy w Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazylia.

1 Student studiów podyplomowych. Departament Pediatrii, FCM/UNICAMP.

2 Adiunkt. Department of Clinical Pathology, FCM/UNICAMP.

3 Adiunkt. Zakład Patologii Anatomicznej, FCM/UNICAMP.

4 Doktorat w dziedzinie genetyki (Instytut Biologii), UNICAMP.

5 Adiunkt. Zakład Genetyki Medycznej, FCM/UNICAMP.

6 Adiunkt. Klinika Pediatrii, FCM/UNICAMP.