Antigenotoxic Effect of Trametes spp. Extracts against DNA Damage on Human Peripheral White Blood Cells

Abstract

Gatunki Trametes są stosowane od tysięcy lat w medycynie tradycyjnej i konwencjonalnej w leczeniu różnego rodzaju chorób. Celem pracy była ocena ewentualnego działania antygenotoksycznego ekstraktów z grzybni i bazidiokarpów wybranych gatunków Trametes oraz ocena zależności od ich potencjału antyoksydacyjnego. Badanymi gatunkami były: Trametes versicolor, T. hirsuta i T. gibbosa. Potencjał antygenotoksyczny ekstraktów oceniano na ludzkich białych krwinkach obwodowych, stosując wyciągi z bazidiokarpu i grzybni tych gatunków. Test komety alkalicznej posłużył do wykrycia uszkodzeń nici DNA i miejsc podatnych na działanie zasad, a także stopnia migracji DNA. Test DPPH posłużył do oceny właściwości antyoksydacyjnych ekstraktów. Ekstrakty z owocników T. versicolor i T. gibbosa oraz ekstrakty z T. hirsuta, z wyjątkiem ekstraktu o stężeniu 20,0 mg/mL, nie były czynnikami genotoksycznymi. Wyciąg z T. versicolor wykazywał w stężeniu 5,0 mg/mL największe działanie antygenotoksyczne zarówno w pre- jak i posttreatmentacji leukocytów. Ekstrakty z grzybni tych trzech gatunków nie wykazywały aktywności genotoksycznej i miały znaczący efekt antygenotoksyczny wobec uszkodzeń DNA indukowanych H2O2, zarówno w pre- jak i posttreatment. Wyniki sugerują, że ekstrakty z tych trzech gatunków mogą być uważane za silne środki antygenotoksyczne zdolne do stymulowania genoprotekcyjnej odpowiedzi komórek.

1. Wprowadzenie

Grzyby są od dawna stosowane jako żywność, ale w równym stopniu w tradycyjnej medycynie zarówno zachodniego, jak i wschodniego świata. Mimo, że liczne grzyby są uznawane za zdrową żywność, ich wielki potencjał farmakologiczny jest wciąż niewykorzystany. Na świecie znanych jest blisko 60 gatunków grzybów z rodzaju Trametes, ale tylko kilka z nich jest badanych pod kątem ich właściwości leczniczych. Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd jest najbardziej znanym gatunkiem leczniczym z tego rodzaju. Ten gatunek, którego ludowe nazwy to Turkey Tail w kulturach zachodnich, Yun-Zhi (grzyb przypominający chmurę) w Chinach lub Kawaratake (grzyb nad brzegiem rzeki) w Japonii, był używany od tysięcy lat w medycynie tradycyjnej, szczególnie w Azji. Według Compendium of Chinese Materia Medica, napisanego w czasach dynastii Ming, zarejestrowano ponad 120 szczepów T. versicolor i w tradycyjnej chińskiej praktyce leczniczej grzyb ten jest uważany za przydatny do usuwania toksyn, wzmacniania, zwiększania energii, poprawy funkcji wątroby i śledziony oraz wzmacniania odpowiedzi immunologicznej, zwłaszcza gdy jest suszony, mielony i przygotowywany na herbatę. Wszystkie te właściwości zostały uznane w medycynie ludowej za bardzo przydatne przy przewlekłym stosowaniu preparatów Trametes spp. W medycynie konwencjonalnej gatunek ten stosowany jest głównie w leczeniu różnego rodzaju nowotworów, ale także w przewlekłym zapaleniu wątroby, reumatoidalnym zapaleniu stawów, infekcjach dróg oddechowych, moczowych i pokarmowych, co zostało potwierdzone licznymi badaniami. Dodatkowo odnotowano silne działanie przeciwwirusowe niektórych polisacharopeptydów wyizolowanych z T. versicolor oraz znaczącą aktywność antyoksydacyjną ekstraktów z owocników Trametes spp. Efekty te opierają się głównie na produkcji polisacharydu krestin (PSK) i różnych kompleksów polisacharydowo-peptydowych, związków, które zmniejszają przerzuty nowotworowe i stymulują produkcję interleukiny-1 w komórkach ludzkich. Obfita obecność wolnych rodników w środowisku wiąże się z pojawieniem się stresu oksydacyjnego, który jest podstawą starzenia się oraz inicjacji i postępu różnych chorób i zaburzeń, na które cierpi i umiera duża część światowej populacji. DNA jest bardziej wrażliwe na uszkodzenia oksydacyjne niż inne makromolekuły. Uszkodzenia DNA, takie jak pęknięcia nici, mogą być indukowane przez różne czynniki, wśród których H2O2 wywołuje efekt genotoksyczny. Wiadomo, że uszkodzenia te mogą wpływać na odpowiedź immunologiczną nie tylko w chorobach zapalnych, ale także w nowotworach. Test kometowy jest dobrze znanym i skutecznym testem o wysokiej czułości, który był wykorzystywany do badania uszkodzeń DNA i może być stosowany do oceny potencjału genotoksycznego i ochronnego kilku produktów naturalnych. Aktywność genoprotekcyjna ekstraktów z grzybów oparta na redukcji uszkodzeń oksydacyjnych DNA może również odgrywać znaczącą rolę w zapobieganiu i leczeniu kilku wymienionych chorób i zaburzeń, ale bardzo niewiele badań do chwili obecnej rozważało ją jako możliwe narzędzie działania w różnych terapiach. Dlatego celem pracy była ocena antygenotoksycznego działania ekstraktów z grzybni i basidiokarpów wybranych gatunków Trametes na ludzkie białe krwinki obwodowe oraz ocena zależności od ich potencjału antyoksydacyjnego.

2. Materiały i Metody

2.1. Organizmy i warunki uprawy

Kultury Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301, i T. gibbosa BEOFB 310 wyizolowano z owocników zebranych z Serbii i utrzymywano na podłożu agarowym Malt w kolekcji kultur Instytutu Botaniki, Wydziału Biologii, Uniwersytetu w Belgradzie (BEOFB).

Inokulum przygotowano przez zaszczepienie 100,0 mL podłoża syntetycznego (glukoza, 10.0 g L-1; NH4NO3, 2.0 g L-1; K2HPO4, 1.0 g L-1; , 0.4 g L-1; , 0.5 g L-1; ekstrakt drożdżowy, 2.0 g L-1; pH 6.5) z 25 krążkami grzybni (Ø 0.5 cm, z 7-dniowej hodowli z agaru słodowego) w kolbach o pojemności 250 mL i inkubacji na wytrząsarce obrotowej przy 100 rpm, w temperaturze pokojowej (°C) przez 7 d. Uzyskaną biomasę przemyto i zhomogenizowano 100,0 mL sterylnej wody destylowanej (dH2O) w mikserze laboratoryjnym. Homogenizowaną biomasę (30.0 mL) użyto do inokulacji 500.0 mL zmodyfikowanego podłoża syntetycznego (z glukozą obecną w ilości 65.0 g L-1). Hodowlę zanurzoną prowadzono w kolbach o pojemności 1000 mL w temperaturze pokojowej na wytrząsarce obrotowej przez 21 d. Uzyskaną biomasę filtrowano, przemywano 3-krotnie dH2O na mieszadle magnetycznym i suszono w temperaturze 50°C do stałej masy.

2.2. Przygotowanie ekstraktów grzybowych

Wysuszone owocniki i grzybnię (3,0 g) ekstrahowano mieszając 90,0 mL 96% etanolu w 30°C przez 72 h. Otrzymane ekstrakty odwirowywano (20°C, 3000 rpm, 15 min), a supernatanty filtrowano przez bibułę filtracyjną Whatman nr 4, zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej (BÜCHI R-114, Szwajcaria) w temperaturze 40°C do sucha i ponownie rozpuszczano w 96% etanolu do oznaczeń antyoksydacyjnych lub w wodzie do oznaczeń antygenotoksycznych do stężenia początkowego 20,0 mg mL-1. Wydajność ekstrakcji wyrażono jako procent w stosunku do suchej masy.

2.3. Aktywność genoprotekcyjna

2.3.1. Podmioty

Heparynizowane próbki krwi pełnej uzyskano przez nakłucie żyły od trzech zdrowych dawców w wieku poniżej 25 lat. Uczestnikami badania były osoby niepalące i niepijące alkoholu, nieprzyjmujące żadnych leków ani terapii, a także nieprzyjmujące suplementów diety.

2.3.2. Study Design

Genotoksyczność wszystkich ekstraktów i stężeń (20.0, 10.0, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, i 0.312 mg mL-1) badano poprzez traktowanie ludzkich obwodowych białych krwinek w temperaturze 37°C przez 30 min w celu oceny uszkodzenia DNA. Zazwyczaj stosuje się białe krwinki, ponieważ są one uzyskiwane w stosunkowo nieinwazyjny sposób, nie wymagają dezagregacji tkanek i dobrze zachowują się w teście kometowym. Traktowanie buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze 37°C przez 30 min było stosowane jako kontrola pozytywna, a traktowanie 25,0 μM H2O2 na lodzie przez 15 min jako kontrola negatywna.

Dwa niezależne protokoły były stosowane do oceny potencjału antygenotoksycznego ekstraktów, wykorzystując traktowanie wstępne i traktowanie po traktowaniu ekstraktami. W traktowaniu wstępnym komórki inkubowano z ekstraktami w temperaturze 37°C przez 30 min, następnie przemywano je PBS i poddawano działaniu H2O2 przez 15 min. W posttreatment, komórki poddawano działaniu H2O2 na lodzie przez 15 min, płukano PBS, a następnie poddawano działaniu siedmiu stężeń ekstraktów w temperaturze 37°C przez 30 min. Po każdym traktowaniu, komórki płukano PBS. Inkubacja z PBS w temp. 37°C przez 30 min stanowiła kontrolę negatywną, a traktowanie 25,0 μM H2O2 na lodzie przez 15 min stanowiło kontrolę pozytywną.

Dla każdego eksperymentu wykonano trzy powtórzenia i dla każdego z nich przeanalizowano 100 jąder.

2.3.3. The Single Cell Gel Electrophoresis Assay

Test kometowy przeprowadzono zgodnie z opisem Singh i wsp. Alkaliczny test kometowy jest w stanie wykryć pęknięcia nici DNA i miejsca podatne na działanie zasad, a zakres migracji DNA wskazuje na stopień uszkodzenia DNA w komórkach.

Próbki krwi pełnej (6,0 μL) zawieszono w 0,67% agarozie o niskim punkcie topnienia (LMP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i pipetowano na rozmrożone szklane szkiełka mikroskopowe pokryte warstwą 1% agarozy o normalnym punkcie topnienia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rozprowadzano za pomocą szkiełka nakrywkowego i pozostawiano na lodzie przez 5 minut w celu zestalenia. Po delikatnym usunięciu szkiełek nakrywkowych, zawiesiny komórek na szkiełkach poddawano działaniu ekstraktów i H2O2, jak opisano powyżej. Po tych zabiegach wszystkie szkiełka pokrywano trzecią warstwą 0,5% agarozy LMP i ponownie pozostawiano na lodzie przez 5 min. Po usunięciu szkiełek nakrywkowych, szkiełka umieszczano w zimnym roztworze lizującym (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100 i 10% dimetylosulfotlenek, pH 10,0 dostosowane za pomocą NaOH) w temperaturze 4°C przez noc, a następnie poddawano elektroforezie i barwieniu bromkiem etydyny. Komety były obserwowane i analizowane przy użyciu mikroskopu Olympus ×50 (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Niemcy), wyposażonego w urządzenie do rejestracji fluorescencji przy 100-krotnym powiększeniu. Ocenę uszkodzeń DNA przeprowadzono zgodnie z opisem Andersona i wsp. Mianowicie, komórki zostały podzielone wzrokowo na pięć kategorii odpowiadających następującym ilościom DNA w ogonku: (A) brak uszkodzeń, <5%; (B) niski poziom uszkodzeń, 5-20%; (C) średni poziom uszkodzeń, 20-40%; (D) wysoki poziom uszkodzeń, 40-95%; (E) całkowite uszkodzenia, >95% (Rysunek 1). Analizę przeprowadzono na 100 losowo wybranych komórkach na podmiot (50 komórek z każdego z 2 szkiełek replikacyjnych). Aby uzyskać półilościową analizę danych, uszkodzenia DNA scharakteryzowano jako migrację DNA powyżej 5% (klasy komet B + C + D + E).

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

2.4. Aktywność antyoksydacyjna

2.4.1. DPPH- Assay

Antioxidant activity was defined by measuring bleaching of the purple-colored methanol solution of stable 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical () . Efekty zmiatania mierzono spektrofotometrycznie (CECIL CE 2501) przy długości fali 517 nm i obliczano za pomocą równania: gdzie jest absorbancją kontroli negatywnej (mieszanina reakcyjna bez ekstraktu) i jest absorbancją mieszaniny reakcyjnej.

Stężenie ekstraktu (mg ekstraktu/mL) zapewniające 50% redukcji (EC50) uzyskano przez interpolację z analizy regresji liniowej. Wszystkie pomiary przeprowadzono w trzech egzemplarzach do analizy statystycznej. Jako kontrolę pozytywną zastosowano antyoksydant handlowy, butylowany hydroksyanizol (BHA), w zakresie stężeń 20,0 mg mL-1-0,02 mg mL-1.

2.4.2. Oznaczanie całkowitej zawartości fenoli

Totalne związki fenolowe w ekstraktach z grzybni oceniano za pomocą odczynnika Folina-Ciocalteu według metody Singletona i Rossiego, stosując kwas galusowy jako wzorzec. Stężenie oznaczono w μg równoważników kwasu galusowego (GAE) na mg suchego ekstraktu, stosując równanie uzyskane z wykresu wzorcowego kwasu galusowego jako

2.4.3. Oznaczanie flawonów ogółem Oznaczanie całkowitej zawartości flawonoidów

Totalna zawartość flawonoidów została oznaczona metodami Park et al. przy użyciu kwercetyny jako standardu. Ilość wyrażono jako μg ekwiwalentów kwercetyny (QE) na mg suchego ekstraktu, stosując równanie uzyskane ze standardowego wykresu hydratu kwercetyny jako

2,5. Analiza statystyczna

Wyniki zostały wyrażone jako średnia ± błąd standardowy danych uzyskanych z trzech równoległych pomiarów. Jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) przeprowadzono przy użyciu oprogramowania STATISTIKA, wersja 5.0 (StatSoft Inc.) w celu zbadania wszelkich istotnych różnic. wartości mniejsze niż 0,01 uznano za istotne statystycznie. Analizę statystyczną danych z testu kometowego przeprowadzono za pomocą testu χ2 przy użyciu oprogramowania Statgraph 4.2. W celu wykonania testu χ2 łączono wyniki z trzech eksperymentów i oceniano całkowitą liczbę komórek z uszkodzeniami DNA. Różnicę na poziomie uznawano za statystycznie istotną.

3. Wyniki i Dyskusja

3.1. Extraction Yield

Extraction yields of mycelium biomass for all three species were significantly higher compared with the fruititing body (). T. gibbosa miał najwyższą wydajność ekstrakcji z wysuszonej biomasy grzybni (34,6%) i najniższą wydajność z wysuszonych owocników (2,2%). Najwyższą wydajność ekstrakcji owocników, wynoszącą 6,67%, stwierdzono u T. versicolor, u którego wydajność ekstrakcji grzybni wynosiła 8,0%. U T. hirsuta wydajność ekstrakcji wynosiła 12,0% (dla grzybni) i 2,85% (dla owocnika). Różnice w wydajności ekstrakcji między gatunkami, zarówno dla grzybni jak i owocnika, były statystycznie istotne ().

Wcześniejsze doniesienia wykazały zależność ekstraktywności biomasy od gatunku, szczepu i rozpuszczalnika. Ren i wsp. stwierdzili, że wydajność ekstrakcji bazidiokarpu T. gibbosa wynosiła 1,22% dla ekstraktu eteru naftowego, 6,44% dla octanu etylu i 9,2% dla ekstraktów metanolowych. Metanol był również dobrym rozpuszczalnikiem dla bazidiokarpu T. versicolor, którego wydajność wahała się od 4,1% do 9,16%. Na podstawie naszych wyników można stwierdzić, że alkohole są najlepszymi rozpuszczalnikami, ale etanol jest słabszy od metanolu.

3.2. Aktywność genoprotekcyjna

Jako że wszyscy krwiodawcy byli w dobrym stanie zdrowia i w podobnym wieku oraz nie przyjmowali żadnych leków, analiza statystyczna nie wykazała wyraźnych różnic w ich reakcjach na ekstrakty. Dlatego też wyniki z trzech eksperymentów zostały połączone. Poddanie leukocytów krwi obwodowej działaniu H2O2 spowodowało szybką i silną indukcję pojedynczych pęknięć nici w jądrowym DNA, co było widoczne w teście kometowym jako migracja DNA.

Nasze wyniki wykazały, że ekstrakty z owocników T. versicolor od 0,312 do 20.0 mg mL-1 nie spowodował istotnego wzrostu całkowitej liczby komórek uszkodzonych przez DNA w porównaniu z kontrolą pozytywną, co jednoznacznie wskazuje, że badany ekstrakt nie był czynnikiem genotoksycznym (Rysunek 2(a) (A)). Rozkład (wartość) całkowitych uszkodzeń DNA był również taki sam jak w kontroli pozytywnej. Z drugiej strony, ekstrakty te wykazywały działanie ochronne wobec H2O2 zarówno w pre- jak i posttreatmentacji leukocytów (Rysunek 2(a) (B, C)). Ekstrakt w stężeniu 5,0 mg mL-1 miał największy efekt, a w stężeniu 20,0 mg mL-1 najmniejszy efekt w obu zabiegach. Wartość całkowitych uszkodzeń DNA uległa statystycznemu obniżeniu w porównaniu z kontrolą pozytywną we wszystkich stężeniach ().

(a)

(b)

(c)

(c)
(a)
(b)
(c)

Rysunek 2

Efekt ekstraktów z owocników (a) Trametes versicolor, (b) T. hirsuta, i (c) T. gibbosa: (A) genotoksyczny, (B) antygenotoksyczny, przed leczeniem, i (C) antygenotoksyczny, po leczeniu. Wykonano trzy niezależne eksperymenty z trzema powtórzeniami na eksperyment i oceniono je testem kometowym. Analizie poddano 100 jąder z każdej repliki. Dane przedstawiają całkowitą liczbę komórek z uszkodzeniami DNA.

Ekstrakt z owocnika T. hirsuta we wszystkich stężeniach z wyjątkiem 20,0 mg mL-1 nie wykazywał aktywności genotoksycznej, ponieważ poziom całkowitych uszkodzeń DNA nie był statystycznie wyższy niż w kontroli pozytywnej (Rysunek 2(b) (A)). Jednakże, przy stężeniu 20,0 mg mL-1, efekt genotoksyczny i całkowite uszkodzenie DNA w komórkach były statystycznie różne w porównaniu z kontrolą pozytywną. W pre- i posttreatmentach leukocytów, ekstrakt we wszystkich stężeniach z wyjątkiem najwyższego wykazywał działanie ochronne przed uszkodzeniami DNA indukowanymi H2O2, wykazując znaczące zmniejszenie całkowitych uszkodzeń DNA w porównaniu z kontrolą pozytywną (Rysunek 2(b) (B, C)). Zabiegi te wykazywały korelację zależną od dawki, z największym efektem ochronnym przy stężeniu ekstraktu 0,312 mg mL-1, podczas gdy stężenie 20 mg mL-1 nie wykazywało żadnej ochrony przed kometami indukowanymi przez H2O2.

Brak efektu genotoksycznego, jak również znaczącego efektu antygenotoksycznego, czyli redukcji uszkodzeń DNA indukowanych przez H2O2, zarówno w pre- jak i posttreatment, odnotowano również dla ekstraktu z owocnika T. gibbosa w siedmiu stężeniach (Rysunek 2(c)). Jednakże, w przeciwieństwie do ekstraktów z T. hirsuta, w przypadku ekstraktów z owocni T. gibbosa nie zaobserwowano odpowiedzi zależnej od dawki; mianowicie, stopniowe zmniejszanie stężenia ekstraktu nie odpowiadało proporcjonalnemu zmniejszeniu genotoksyczności indukowanej H2O2.

Wyciągi z grzybni T. versicolor, T. hirsuta i T. gibbosa, we wszystkich analizowanych stężeniach, nie wykazywały aktywności genotoksycznej (Ryc. 3(a) (A), 3(b) (A) i 3(c) (A)). Wszystkie ekstrakty i stężenia grzybni wykazywały istotne działanie antygenotoksyczne wobec uszkodzeń DNA indukowanych H2O2, zarówno w pre- jak i posttreatment, a aktywności te nie różniły się istotnie. W przypadku T. versicolor nieco niższą aktywność odnotowano przy najniższym stężeniu ekstraktu. U T. hirsuta bardziej skuteczne były stężenia 5,0, 2,5 i 20,0 mg mL-1, natomiast u T. gibbosa największy efekt ochronny obserwowano przy stężeniu 2,5 mg mL-1, a najmniejszy przy 20,0 mg mL-1 (rys. 3(a) (B, C), 3(b) (B, C) i 3(c) (B, C)).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Rysunek 3

Efekt ekstraktów z grzybni (a) Trametes versicolor, (b) T. hirsuta, i (c) T. gibbosa: (A) genotoksyczny, (B) antygenotoksyczny, przed leczeniem, i (C) antygenotoksyczny, po leczeniu. Wykonano trzy niezależne eksperymenty z trzema powtórzeniami na eksperyment i oceniono je testem kometowym. Analizie poddano 100 jąder z każdej repliki. Dane przedstawiają całkowitą liczbę komórek z uszkodzeniami DNA.

Numeryczne związki mutagenne i rakotwórcze są obecne w różnych źródłach naturalnych. Z drugiej strony, niektóre związki naturalne mogą być albo prooksydantami powodującymi efekty genotoksyczne i/lub cytotoksyczne, albo antyoksydantami, w zależności od stężenia i czasu ekspozycji. Gatunki grzybów o wysokich wartościach odżywczych i leczniczych mogą mieć różne efekty in vitro i in vivo ze względu na ich niestabilność w warunkach trawienia lub niezdolność do wchłaniania przez przewód pokarmowy. Mianowicie, działania uzyskane in vitro nie muszą odpowiadać tym stwierdzonym in vivo. Należy również podkreślić, że genotoksyczne i antygenotoksyczne działanie ekstraktów z grzybów zależy od gatunku, stężenia i sposobu ich oceny. Tak więc, nasze wyniki wykazały różne zdolności trzech gatunków Trametes do zmniejszania uszkodzeń DNA wywołanych przez H2O2; na przykład, najniższą aktywność odnotowano w ekstrakcie z owocnika T. hirsuta. Wyraźna odwrotna zależność dawka-odpowiedź pomiędzy poziomem uszkodzeń DNA a stężeniem ekstraktu została odnotowana tylko w przypadku ekstraktu z owocnika T. hirsuta. Natomiast w przypadku T. versicolor i T. gibbosa zwiększanie stężenia ekstraktu powyżej dawki optymalnej nie prowadziło do poprawy wyników kometowania, co potwierdza wyniki badań Miyaji i wsp. Autorzy ci wykazali brak zależności dawka-odpowiedź pomiędzy stężeniem ekstraktu Lentinus edodes a jego działaniem antygenotoksycznym. Ważne jest, aby wspomnieć, że połączone fenole, flawonoidy i inne składniki ekstraktów powinny mieć większy potencjał niż poszczególne składniki ekstraktów, co wskazuje na znaczenie współdziałania wszystkich składników. Stwierdzenie to może skutkować odmiennym trendem aktywności antygenotoksycznej Trametes spp. Zależność aktywności genotoksycznej ekstraktu od rodzaju testu wykazali Morales i wsp.; tj. stwierdzili brak działania mutagennego ekstraktów z bazidiokarpów Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus i Pleurotus ostreatus na komórki ssaków przy użyciu testu Amesa Salmonella/mikrosomowego. Jednakże słabą aktywność ekstraktu z P. ostreatus uzyskano stosując test CHO/HPRT.

Mechanizmy leżące u podstaw antygenotoksycznego działania ekstraktów z grzybów nadal nie są do końca poznane. Efekty ochronne ekstraktów wydają się być oparte na więcej niż jednym mechanizmie działania, co nie jest rzadkością w przypadku grzybów według Gebharta. Mechanizmy antygenotoksyczności mogły być oceniane poprzez zastosowanie pre- i posttreatment, czyli różnych kombinacji ekstraktów i H2O2. Nasze pozytywne wyniki w obu zabiegach wskazują, że ekstrakty mają działanie ochronne zarówno na poziomie prewencyjnym jak i interwencyjnym i mogą działać jako desmutageny i bioantymutageny, co zostało również wykazane w poprzednich badaniach. Skuteczność leczenia wstępnego, odnotowana w niniejszym badaniu, może być tłumaczona zwiększeniem zdolności antyoksydacyjnej komórek, czyli stymulacją syntezy i aktywności enzymów antyoksydacyjnych podczas indukcji stresu oksydacyjnego. Pozytywny efekt posttreatment może być wynikiem synergistycznego działania interwencyjnego poprzez zmiatanie wolnych rodników i stymulację enzymów antyoksydacyjnych, a także pobudzenie naprawy DNA, jak sugerują Chiaramonte i wsp. Ponieważ autorzy ci odnotowali znaczącą naprawę uszkodzeń DNA po 30-60 min ekspozycji na czynnik oksydacyjny, można wnioskować, że naprawa DNA odgrywała mniej znaczącą rolę w ochronie przed H2O2, ponieważ warunki po leczeniu uwzględniały do 30 min inkubacji. Dlatego też aktywność genoprotekcyjna ekstraktów Trametes spp. opiera się prawdopodobnie na działaniach antyoksydacyjnych. Z drugiej strony wiadomo, że organizmy eukariotyczne wykształciły ścieżkę sygnalizacyjną, zwaną odpowiedzią na uszkodzenia DNA, w celu ochrony przed uszkodzeniami genomu. Gasser i Raulet wykazali, że odpowiedź na uszkodzenia DNA alarmuje układ odpornościowy poprzez indukowanie ekspresji ligandów powierzchni komórek dla aktywującego receptora immunologicznego NKG2D, który jest wyrażany przez komórki NK (natural killer cells) i niektóre limfocyty T. Dlatego też genoprotekcyjne działanie Trametes spp. w komórkach narażonych na czynniki genotoksyczne może modulować odpowiedź na uszkodzenia DNA i funkcjonować jako bariera we wczesnej fazie nowotworzenia. Dalsze badania powinny obejmować analizę poziomu dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w limfocytach traktowanych ekstraktami Trametes spp. zarówno przed jak i po traktowaniu H2O2, w celu potwierdzenia przypuszczenia, że wzmocnienie zdolności antyoksydacyjnych w komórkach jest indukowane przez te ekstrakty.

3.3. Aktywność antyoksydacyjna

Badane ekstrakty etanolowe były dobrymi antyoksydantami, ale ich aktywność zależała od gatunku. Ekstrakty z owocników wykazywały istotnie wyższe działanie zmiatające niż ekstrakty z grzybni (). Najwyższą aktywność zmiatania rodnika DPPH stwierdzono w ekstraktach z T. versicolor, zarówno z owocnika, jak i z grzybni (odpowiednio 63,5% i 59,4%), co potwierdzają wartości EC50 (odpowiednio 15,22 mg mL-1 i 16,18 mg mL-1). Nieco niższą aktywność wykazały ekstrakty z T. hirsuta (59,0% dla bazidiokarpów i 46,8% dla grzybni), których stężenia odpowiednio 17,06 mg mL-1 i 21,81 mg mL-1 zapewniały 50% redukcję rodników. T. gibbosa był gatunkiem o najniższym potencjale zmiatania rodników, zwłaszcza z ekstraktów z grzybni (39,7%), a wartość EC50 wynosiła 26,15 mg mL-1. Natomiast zdolność zmiatania rodników przez ekstrakt z owocnika nie była istotnie niższa w porównaniu z pozostałymi dwoma gatunkami (53,7% i EC50 18,13 mg mL-1). Aktywność zmiatająca syntetycznego przeciwutleniacza BHA wynosiła 94,28%, a stężenie 0,10 mg mL-1 zapewniało redukcję o 50%.

Totalna zawartość fenoli w ekstraktach z owocników i grzybni gatunków Trametes była istotnie różna () (tab. 1). Generalnie, zawartość fenoli w ekstraktach z owocników była wyższa niż w ekstraktach z grzybni.

Najbogatsze w fenole i flawonoidy były ekstrakty z bazidiokarpu i grzybni T. versicolor, natomiast najniższe stężenia oznaczono w ekstraktach z T. gibbosa. Pod względem stężenia fenoli i flawonoidów ekstrakty z T. hirsuta plasowały się pomiędzy ekstraktami pozostałych dwóch gatunków (tab. 1). Stopień korelacji pomiędzy aktywnością zmiatającą ekstraktów a zawartością fenoli i flawonoidów był wysoki i wynosił dla owocników odpowiednio 0,98 i 0,99, a dla grzybni odpowiednio 0,97 i 0,99.

Wcześniejsze badania również wskazywały na potencjał antyoksydacyjny gatunków Trametes. I tak, Kamiyama i wsp. wykazali, że stężenie ekstraktu wynoszące nawet 0,5 mg mL-1 zmiatało prawie 50% rodników w zależności od rozpuszczalnika, natomiast Johnsy i Kaviyarasana odnotowali redukcję nawet 91,5% rodników przez metanolowy ekstrakt z basidiocarps T. gibbosa w stężeniu 1,0 mg mL-1. Ekstrakty etanolowe badane w naszych badaniach miały nieco niższe zdolności, ale wyższe niż etanolowe ekstrakty owocników T. hirsuta analizowane przez Sheikh i wsp.

Według Mau i wsp. oraz Palacios i wsp. związki fenolowe odgrywają kluczową rolę w aktywności antyoksydacyjnej. Związki te są bardzo obfitymi i ważnymi składnikami owocników i grzybni pieczarek. Ich zdolności opierają się na obecności grup hydroksylowych działających jako reduktory, chelatory metali, wygaszacze tlenu singletowego i donory wodoru. Jednak w niektórych przypadkach ich aktywność nie może być przypisana do całkowitej zawartości fenoli w ekstraktach, co potwierdza porównanie naszych wyników z wynikami Johnsy’ego i Kaviyarasany. Mianowicie, 91,5% rodników zostało zredukowanych przez ekstrakt z bazidiokarpu T. gibbosa zawierający 23,8 μg GAE mg-1 ekstraktu, podczas gdy ekstrakt ze szczepu BEOFB 310 o stężeniu fenolu 20,07 μg GAE mg-1 ekstraktu zmiótł tylko 63,5% rodników. Jednakże stężenie flawonoidów w serbskim szczepie T. gibbosa było znacznie wyższe w porównaniu ze szczepem badanym przez Johnsy’ego i Kaviyarasanę (odpowiednio 7,63 μg QE mg-1 ekstraktu i 0,59 μg QE mg-1 ekstraktu), co można tłumaczyć różną polarnością rozpuszczalników, jak również różną zdolnością szczepu do syntezy flawonoidów.

4. Wnioski

Badania te były pierwszą próbą oceny aktywności ochronnej DNA ekstraktów T. versicolor, T. hirsuta i T. gibbosa i określenia, czy była ona oparta na ich potencjale antyoksydacyjnym. Wyniki sugerują, że ekstrakty z tych trzech gatunków mogą być uważane za silne środki antygenotoksyczne zdolne do stymulowania genoprotekcyjnej odpowiedzi komórek przyczyniając się do poprawy funkcji immunologicznych, usuwania toksyn i wzmacniania, co nawiązuje do tradycyjnego zastosowania. Jednakże, konieczne są dalsze badania w celu ujawnienia specyficznych nośników aktywności antygenotoksycznej i sposobu ochrony DNA przed uszkodzeniami oksydacyjnymi.

Konflikt interesów

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów w związku z publikacją tej pracy.

Podziękowania

Autorzy dziękują profesorowi dr Steve’owi Quarrie, profesorowi wizytującemu na Uniwersytecie w Newcastle, UK, za korektę i poprawę języka angielskiego. Badanie przeprowadzono przy wsparciu finansowym Ministerstwa Edukacji, Nauki i Rozwoju Technologicznego Republiki Serbii, Projekt nr 173032 i Projekt nr 173034.

.