A Comparison of Immunohistochemistry and Western Blot

By Sarah Moore, M.Sc.Reviewed by Michael Greenwood, M.Sc.

Immunohistochemia i Western blot działają poprzez wykorzystanie zasady specyficznego wiązania się przeciwciał z antygenami obecnymi w tkance biologicznej.

Image Credit: Sinitar/.com

Immunohistochemia jest najbardziej powszechną z technik barwienia immunologicznego. Wizualizuje ona obecność antygenów w próbce tkanki poprzez użycie przeciwciał, które przyłączają się do antygenów, wywołując efekt katalityczny i rozszczepiając cząsteczkę na możliwe do zidentyfikowania związki. Wizualizacja tej interakcji może być osiągnięta przez użycie enzymu (wytwarzającego sygnał chromogenny) lub fluoroforu (tworzącego sygnał fluorescencyjny).

Western blot działa na tej samej zasadzie. Został on po raz pierwszy opisany w latach 70-tych, kiedy to naukowcy po raz pierwszy wykorzystali go do skutecznej klasyfikacji różnych białek występujących w tkance biologicznej. Od tego czasu poczyniono znaczne postępy w technologii, co doprowadziło do ustanowienia nowoczesnej fluorescencyjnej, kolorymetrycznej i chemiluminescencyjnej techniki Western blot.

Wszystkie wersje metody Western blot polegają na działaniu kompleksu antygen-przeciwciało w celu identyfikacji specyficznych białek obecnych w próbce, wskazanych przez reakcje enzym-substrat cząsteczek kolorymetrycznych, chemiluminescencyjnych lub fluorescencyjnych. Światło wytwarzane przez te źródła może być wykorzystane do wnioskowania o obecności i stężeniu białek w próbce.

Porównanie technik

Pomimo, że obie metody opierają się na zasadzie interakcji przeciwciało-antygen, istnieją pewne istotne różnice pomiędzy tymi dwiema technikami. Poniżej przedstawiamy je krok po kroku.

Po pierwsze, w przypadku obu technik, próbka musi być prawidłowo przygotowana. Przygotowanie to różni się dość znacznie pomiędzy tymi dwoma technikami. W przypadku immunohistochemii, próbki tkanek są krojone lub pozostawiane w całości, w zależności od ich wielkości.

Graniczna wielkość próbek waha się zazwyczaj od 3 µm do 5 µm. Następnie próbki są zatapiane w medium, zwykle w parafinie lub kriomedium. Następnie plasterki umieszczane są na szkiełkach i odwadniane przy użyciu coraz mocniejszych przemywań alkoholem, kończąc na dodaniu detergentu w celu oczyszczenia próbki, co czyni ją gotową do oglądania pod mikroskopem.

Z drugiej strony, Western blot wymaga, aby próbki były najpierw oddzielone przez elektroforezę, a następnie unieruchomione w błonie blottingowej.

Metoda barwienia próbek jest również nieco inna pomiędzy tymi dwoma technikami. Immunohistochemia dodaje przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne. Przeciwciała te są klasyfikowane jako odczynniki pierwotne lub wtórne, przy czym pierwsze z nich są hodowane przeciwko docelowemu antygenowi i są zazwyczaj niesprzężone, natomiast drugie są sprzężone z cząsteczką łącznika, która następnie rekrutuje cząsteczki reportera.

Wersja sprzężona jest stosowana w bezpośredniej metodzie barwienia, gdzie przeciwciało bezpośrednio reaguje z antygenem w próbce, wersja niesprzężona jest stosowana w pośredniej metodzie barwienia, gdzie nieznakowane przeciwciało wiąże się z docelowym antygenem w tkance, powodując reakcję przeciwciała drugorzędowego z przeciwciałem pierwszorzędowym.

W porównaniu, w metodzie Western blot do próbki dodawany jest barwnik fluorescencyjny, po czym następuje ekspozycja na źródło światła o odpowiedniej długości fali w celu wzbudzenia cząsteczek fluoroforów.

Po pewnym czasie wzbudzone fluorofory ostatecznie uwalniają energię, którą uzyskały ze źródła światła, aby powrócić do stanu podstawowego. To uwolnienie energii sprawia, że fluorofory fluoryzują, emitując światło, które może być przechwycone przez cyfrową wywoływarkę.

Porównanie korzyści i wad

Główną zaletą immunohistochemii jest to, że metoda ta pozwala badaczom na wykrycie dokładnej lokalizacji docelowego białka w próbce tkanki. Ta główna zaleta sprawiła, że stała się ona dobrze ugruntowana w dziedzinie neurobiologii jako solidna metoda badania ekspresji białek w docelowych lokalizacjach mózgu.

Z drugiej strony, metoda ta ma poważną wadę w porównaniu z metodą Western blot. Jest to fakt, że plamy nie są sprawdzane względem drabiny masy cząsteczkowej, jak to ma miejsce w Western blot, co oznacza, że nie ma sposobu na udowodnienie, że barwienie wykazane w immunohistochemii jest jednoznacznie związane z określonym białkiem.

Pośrednia metoda immunohistochemii jest uznawana za wysoce czułą, jednakże metoda bezpośrednia jest znana z bycia przeciwieństwem i jest ogólnie niezdolna do wykrywania małych stężeń docelowych antygenów.

Metoda Western blot jest korzystna w tym sensie, że została ustanowiona jako wiarygodna technika gromadzenia danych ilościowych. Jednak jej najważniejszą zaletą jest to, że okazała się skuteczna w generowaniu sygnału, który jest proporcjonalny do ilości białka występującego w próbce.

Metoda Western blot jest często wybierana ze względu na jej zdolność do jednoczesnego wykrywania wielu białek docelowych, co skutkuje znacznym skróceniem czasu badania, jak również zmniejszeniem liczby wymaganych zasobów.

Różnica w zastosowaniach

W zastosowaniach tych dwóch technik istnieje wiele zbieżności, biorąc pod uwagę, że są one tak podobne. Jednak ogólnie rzecz biorąc, immunohistochemia jest najczęściej stosowana jako narzędzie diagnostyczne w przypadku licznych nowotworów.

Metoda ta jest wykorzystywana do identyfikacji nieprawidłowych komórek, które są charakterystyczne dla niektórych nowotworów. Metoda ta jest również szeroko wykorzystywana do identyfikacji i lokalizacji białek i biomarkerów występujących zarówno w prawidłowych, jak i chorych tkankach. Wreszcie, jest ona również powszechnie stosowana do wykrywania licznych organizmów zakaźnych w tkankach.

W porównaniu, Western blot jest najczęściej stosowany do wykrywania chorób autoimmunologicznych, alergii i chorób zakaźnych. Jest on szeroko stosowany w dziedzinie biologii molekularnej, biochemii i biologii komórki, a jego najbardziej godne uwagi zastosowania są wykorzystywane jako narzędzie diagnostyczne dla HIV i BSE.

Dalsza lektura

• Wszystkie treści dotyczące immunohistochemii
• Immunohistochemia (IHC) Techniki obrazowania
• Enzymatyczna immunohistochemia (IHC)
• Wielokolorowa immunohistochemia (IHC)
• Jak działa immunochemia?

Written by

Sarah Moore

Po studiach psychologicznych, a następnie neurobiologicznych, Sarah szybko odnalazła swoją radość w badaniu i pisaniu prac badawczych; przekształcając się w pasję do łączenia pomysłów z ludźmi poprzez pisanie.

Cytaty

.