Il test ossidativo-fermentativo (OF) fu sviluppato da Hugh e Leifson nel 1953. Essi svilupparono i mezzi OF per differenziare i batteri ossidativi (che producono acido dai carboidrati solo in condizioni aerobiche) dai batteri fermentativi (che producono acido sia in condizioni aerobiche che anaerobiche).
I microorganismi saccarolitici degradano il glucosio sia in modo fermentativo che ossidativo. I prodotti finali della fermentazione sono acidi misti relativamente forti che possono essere rilevati in un mezzo di prova di fermentazione convenzionale. Tuttavia, gli acidi formati nella degradazione ossidativa del glucosio sono estremamente deboli e meno, e il mezzo di fermentazione di ossidazione più sensibile del mezzo OF di Hugh e Leifson è richiesto per il rilevamento. Il mezzo è stato realizzato aumentando la quantità di glucosio al di sopra di quella trovata nel mezzo usato per rilevare la fermentazione e diminuendo la quantità di peptone.
Il mezzo OF di Hugh e Leifson differisce dai mezzi di fermentazione dei carboidrati come segue:
- La concentrazione di agar è diminuita al 2% dal 3%, rendendolo semisolido nella consistenza (questo aiuta nella determinazione della motilità dell’organismo).
- La concentrazione di peptone è diminuita dall’11% al 2%. (diminuendo la quantità di prodotto alcalino prodotto dal metabolismo del peptone; riducendo così l’effetto neutralizzante di questi prodotti).
- La concentrazione di carboidrati è aumentata da 0,5% a 1.0% (l’aumento della concentrazione di glucosio nel mezzo aumenta la produzione di questi acidi deboli ad un livello che può essere rilevato dall’indicatore blu di bromthymol.)
Principio:
Il test ossidativo-fermentativo determina se certi bastoncini gram-negativi metabolizzano il glucosio tramite fermentazione o respirazione aerobica (ossidativamente). Durante il processo anaerobico di fermentazione, il piruvato viene convertito in una varietà di acidi misti a seconda del tipo di fermentazione. L’alta concentrazione di acido prodotta durante la fermentazione trasformerà l’indicatore blu di bromthymol in OF media da verde a giallo in presenza o assenza di ossigeno.
Alcuni batteri gram-negativi non fermentanti metabolizzano il glucosio usando la respirazione aerobica e quindi producono solo una piccola quantità di acidi deboli durante la glicolisi e il ciclo di Krebs. La diminuzione della quantità di peptone e l’aumento della quantità di glucosio facilita il rilevamento degli acidi deboli così prodotti. Il tampone fosfato dipotassico viene aggiunto per promuovere ulteriormente il rilevamento degli acidi.
Usi:
Il test OF viene utilizzato per determinare se i batteri gram-negativi metabolizzano i carboidrati in modo ossidativo, per fermentazione, o sono nonsacchrolitici (non hanno alcuna capacità di utilizzare i carboidrati nei media).
Media:
Hugh and Leifson’s OF basal medium; i costituenti sono i seguenti:
- Cloruro di sodio: 5.0 g
- Fosfato di potassio: 0.3 g
- Peptone: 2.0 g
- Blu di bromotimolo:0.03 g
- Agar: 3.0 g
- Glucosio: 10 g
- Acqua: 1000 ml
Il pH dovrebbe essere regolato a 7.1 prima della sterilizzazione in autoclave. Dopo aver sterilizzato in autoclave il terreno a 121°C per 15 minuti, una soluzione sterilizzata con filtro di una soluzione al 10% di carboidrati viene aggiunta asetticamente al terreno fino ad una concentrazione finale dell’1%.
Procedura
- Inoculare due provette di terreno di prova OF con l’organismo di prova usando un filo dritto infilzando “a metà strada verso il fondo” della provetta.
- Coprire una provetta di ogni coppia con uno strato di 1 cm di olio minerale sterile o paraffina liquida (crea una condizione anaerobica nella provetta impedendo la diffusione dell’ossigeno), lasciando l’altra provetta aperta all’aria.
- Incubare entrambe le provette a 35°C per 48 ore (I batteri a crescita lenta possono impiegare da 3 a 4 giorni prima che i risultati possano essere osservati)
Interpretazione
La produzione di acido è rilevata nel mezzo dalla comparsa di un colore giallo. Nel caso di organismi ossidativi; la produzione di colore può essere notata prima vicino alla superficie del mezzo.
Seguono i modelli di reazione:
- Risultato fermentativo: Produzione di acido su entrambe le provette (aperte e coperte). L’acido prodotto cambia l’indicatore di pH, blu di bromtimolo, da verde a giallo. es. Escherichia coli
- Risultato ossidativo: La produzione di acido nella provetta aperta (aerobica) e non in quella coperta di olio (anaerobica) indica un risultato ossidativo. I batteri non fermentanti che metabolizzano il glucosio tramite metabolismo ossidativo danno un risultato ossidativo. ad esempio Pseudomonas aeruginosa
- Non saccarolitici (risultato OF negativo): I batteri non saccarolitici danno un risultato OF negativo. Il risultato negativo è indicato da nessun cambiamento di colore nella provetta coperta di olio e in alcuni casi un aumento del pH (pH 7.6) che cambia il blu di bromtimolo da verde a blu nella parte superiore della provetta aperta. L’aumento del pH è dovuto alla produzione di ammina da parte dei batteri che scompongono il peptone (proteina) nel mezzo.
es. Alcaligenes faecalis.
Controllo di qualità
- Fermentatore di glucosio: Escherichia coli
- Fermentatore di glucosio: Pseudomonas aeruginosa
- Nonsaccarolitico: Moraxella species
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