Risultati e discussione
Struttura complessiva del dominio TE. Anche se la struttura del dominio TE isolato che è stato risolto rappresenta due molecole indipendenti (1 e 2) nell’unità asimmetrica (Tabella 1), il dominio è stato purificato e completamente attivo come un monomero (Z.G. e B.C., dati non pubblicati). Il FAS umano nativo è disposto come un omodimero antiparallelo testa-coda (1) come visualizzato recentemente nelle mappe di crio-microscopia elettronica (cryo-EM) (31). Questa disposizione collocherebbe i due domini TE dei monomeri FAS alle estremità opposte l’uno dall’altro, non conferendo alcuna rilevanza funzionale alla formazione di un dimero. Per queste ragioni, il dimero è un artefatto della cristallizzazione. La struttura della molecola 1 è considerata qui di seguito come rappresentante della struttura.
Il dominio TE del FAS umano comprende due sottodomini (A e B) (Fig. 1). Il più grande sottodominio A (≈23 kDa) è costituito da due segmenti non contigui dalle estremità terminali amino- (o N-) e carbossilica (o C-) (Figg. 1, 2, 3). Il segmento intermedio è consegnato al più piccolo (≈9-kDa) sottodominio B. Il sottodominio A ha una piega complessiva α/β, mentre il sottodominio B ha un motivo tutto α-elico. L’intera struttura è composta da nove α-eliche e otto filamenti β (Figg. 1 e 2). La maggior parte dell’intera struttura del dominio TE potrebbe essere inserita nella densità elettronica, tranne i tre segmenti e un residuo di glicina mostrati nelle Figg. 1, 2, 3, con densità mancante o debole, indicando la loro alta mobilità. Tutti i segmenti disordinati sono in regioni esposte al solvente e da nessuna parte sono coinvolti nei contatti cristallini.
I tre residui catalitici del FAS TE umano (Ser-2308, His-2481, e Asp-2338) sono legati tra loro e ai residui vicini da una vasta rete di legami a idrogeno (Fig. 4). Il gruppo idrossile del Ser-2308 è coinvolto in un legame a idrogeno cooperativo, accettando dal backbone amidico adiacente di Tyr-2309 e donando a Nε2 di His-2481. Questo, a sua volta, faciliterebbe l’attivazione del Ser-2308 come nucleofilo e aiuterebbe a stabilizzare l’intermedio tetraedrico di ossianioni che ci si aspetta si formi durante la reazione catalitica TE come visto nelle idrolasi della serina. Il residuo His-2481 (Nε2) è a sua volta legato a idrogeno all’Asp-2338 (Oδ2). L’Asp-2338 (atomo Oδ1) crea ulteriori legami a idrogeno sia con l’ammide della spina dorsale di Ala-2448 che con il gruppo idrossile di Tyr-2462. Tyr-2462 è completamente invariante, mentre Ala-2448 è parzialmente conservato dagli insetti ai mammiferi (Fig. 3). Quindi l’interazione tra questi residui e il residuo catalitico aspartato sembra essere importante per mantenere l’Asp-2338 fisso nella sua particolare posizione, indicando ulteriormente l’importante ruolo giocato da questo residuo. L’estesa rete di legami a idrogeno nel sito catalitico mantiene l’enzima pronto per l’azione orientando e posizionando i residui catalitici nelle posizioni richieste, in modo molto simile a quelli delle serina idrolasi (40).
Specificità del sito di legame della catena di palmitoil e della lunghezza della catena. Per ottenere una comprensione del meccanismo con cui il dominio TE di FAS regola la specificità della lunghezza della catena, abbiamo analizzato la struttura TE per la presenza di un solco vicino al centro catalitico che potrebbe ospitare substrati a catena acilica lunga. La presenza di un solo solco è evidente, che si trova all’interfaccia tra i sottodomini A e B (Fig. 5). L’analisi con proshape (vedi Materiali e Metodi) ha confermato la presenza del solco con un volume di 186,9 Å3 e una superficie di 140 Å2, la cui estremità distale forma una tasca (Fig. 5). Il solco è vicino al terminale amminico del dominio TE, che è collegato al dominio ACP di FAS che trattiene le catene aciliche in crescita per la scansione e il rilascio da parte del dominio TE dopo aver raggiunto la lunghezza ottimale della catena di acidi grassi a 16 carbonio. La maggior parte dei residui che rivestono il solco provengono dall’elica ampifila α8 del sottodominio B. Altri residui che vi contribuiscono provengono dall’elica α5 del sottodominio B, dall’elica N-terminale α1 del sottodominio A, e dal loop tra β2 e α2 del sottodominio A. I residui che rivestono il solco, che sono per lo più di natura idrofoba, sono costituiti da Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423, e Lys-2426 da α8 elica, Phe-2370 e Phe-2371 da α5 elica, Leu-2222, Leu-2223, e Val-2224 da α1 elica, e Ile-2250 e Glu-2251 dal ciclo tra β2 e α2 (Fig. 5A). Di questi residui, Ile-2250, Glu-2251, e Lys-2426 sono invarianti tra le specie, mentre Val-2224, Phe-2371, Ala-2419, e Phe-2423 sono per lo più conservati (Fig. 3). Il resto dei residui sono completamente conservati nei mammiferi (Fig. 3). Tutte le osservazioni di cui sopra, prese insieme, suggeriscono l’interfaccia tra i due sottodomini come un’eccellente regione di legame della catena di acidi grassi. Due esperimenti sono stati intrapresi per dare credito a questo suggerimento e per ottenere informazioni sulla selettività della catena degli acidi grassi.
Sito di legame dei lipidi. (A) Stereoview del candidato palmitoyl legame scanalatura per i primi 11-12 carboni e la tasca per gli ultimi 5-4 carboni. L’inibitore hexadecyl sulfonyl è rappresentato come un modello di riempimento dello spazio Corey-Pauling-Koltun (C, giallo; O, rosso; S, verde). Le catene laterali che rivestono il solco sono mostrate come figure di palle e bastoni (C, giallo; O, rosso; N, blu). Le catene laterali che compongono il sito attivo sono anch’esse mostrate come figure a sfera e bastone con uno schema di colori simile a quello dei residui. La mappa della superficie del solco è mostrata in rete metallica verde. I residui che compongono il solco sono etichettati tranne Ile-2250, che non può essere visto perché cade sotto l’inibitore. Gli iniziali 11-12 atomi di carbonio del gruppo sulfonilico sono esposti al solvente con l’11° e il 12° atomo di carbonio alla bocca della tasca. (B) Una vista diversa della scanalatura e della tasca. Le frecce denotano le rotazioni nell’andare dall’orientamento della vista in A a B. Questa vista mostra che la maggior parte della catena acilica grassa dell’inibitore esadecilico è esposta al solvente.
In primo luogo, abbiamo dimostrato mediante mutagenesi sito-diretta che le sostituzioni di diversi residui che rivestono il solco e la tasca del dominio TE hanno ridotto l’attività TE, anche se in misura diversa (Tabella 2).
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In secondo luogo, siamo stati in grado di modellare il legame di un C16 palmitoyl catena contenente inibitore hexadecyl sulfonyl f luoride (HDSF) nel solco. La modellazione è stata guidata dai dati della struttura cristallina della proteina palmitoilica TE 1 (PPT1) con esadecil solfonato (HDS) covalentemente legato (codice PDB ID 1exw; rif. 41) e aumentata dalla minimizzazione dell’energia in cns. Come TE, il sito catalitico di PPT1 contiene una triade catalitica conservata di serina, istidina e aspartato. La struttura del complesso PPT1-HDS ha mostrato la formazione del legame covalente tra l’atomo di zolfo di HDS e l’atomo di ossigeno della serina catalitica e la presenza della catena acilica grassa in un lungo solco superficiale prevalentemente idrofobico della proteina (41). La modellazione dell’HDS legata covalentemente nella struttura TE (mostrata in Fig. 5) ha rivelato diverse caratteristiche del legame del ligando con importanti implicazioni funzionali e biochimiche. L’adattamento dell’HDS non ha causato alcun riarrangiamento importante dei residui nel sito di legame. La catena palmitoilica fa una brusca curva rispetto al gruppo sulfonato in modo simile a quello visto nella struttura legata PPT1. La catena palmitoilica a 16 atomi di carbonio si adatta bene al solco con i primi ≈12 atomi di carbonio esposti al solvente e i restanti ≈4 atomi di carbonio inseriti e tenuti in posizione nella tasca distale. Questo adattamento è pienamente coerente con l’osservazione che il FAS TE dei mammiferi catalizza la formazione di acido palmitico come suo prodotto principale (20). La presenza degli ultimi ≈4 atomi di carbonio nella tasca aiuta a legare la catena di acidi grassi in posizione per l’idrolisi del substrato acilico palmitoil. La natura del sito di legame, che combina un solco esposto con una tasca chiusa, è unica e progettata per la specificità di questo TE. La scoperta che il dominio TE dei FAS dei mammiferi non mostra alcuna attività significativa verso catene aciliche di lunghezza inferiore a 14 atomi di carbonio (20) può essere spiegata da un legame non produttivo dovuto alla mancanza di legami e alla conseguente maggiore mobilità delle catene più corte esposte. Gli ultimi ≈4 atomi di carbonio della catena palmitoilica occupano parzialmente la tasca distale, lasciando abbastanza spazio per ospitare solo 2 atomi di carbonio aggiuntivi. Questo risultato è coerente con la drammatica perdita di attività osservata con substrati modello più lunghi di 18 atomi di carbonio (20). Non è chiaro se gli ultimi ≈4 e ≈6 atomi di carbonio delle catene aciliche grasse C16 e C18, rispettivamente, saranno inseriti in una tasca preformata tra i due sottodomini come visto nella struttura della forma non legata, o saranno legati inizialmente a una forma aperta del dominio che poi successivamente subisce un movimento di piegatura a cerniera tra i sottodomini per racchiudere gli atomi di carbonio terminali delle catene aciliche grasse e creare la configurazione produttiva della regione del sito attivo.
Sono stati fatti notevoli sforzi per cristallizzare TE con vari analoghi di acidi grassi a catena lunga (ad es, palmitoyl-CoA, myristoyl-CoA, stearoyl-CoA, acido palmitico, hexadecyl sulfonyl fluoride, e acido palmitico), ma non sono state trovate strutture complesse stabili di lunga durata. La maggior parte dei complessi, come dimostrato dall’attività enzimatica indipendente o dai saggi di legame radioattivo in soluzione, si sono dissociati entro 5 minuti a 1 ora, rendendoli inadatti alla cristallizzazione o alle prove di ammollo del cristallo.
Cryo-EM Fit della struttura TE. Anche se la struttura di ricostruzione 20-Å cryo-EM del dimero FAS umano è stata descritta (31), non c’era alcuna indicazione della polarità da N a C-terminale della subunità FAS, tranne che per una precedente indicazione da etichettatura anticorpale che il dominio FAS TE era situato ad una delle estremità dell’intera struttura (42). Abbiamo tentato una valutazione preliminare della polarità agganciando manualmente la struttura più piccola (32 kDa) del dominio FAS TE umano, che occupa l’estremità C-terminale della subunità FAS, e la più grande (42 kDa) della β-ketoacy di E. coli β-chetoacil sintasi I (o KSI) struttura di cristallo (PDB ID codice 1ek4) (43), che è uno stretto omologo del dominio KS N-terminale del FAS mammifero, in ogni estremità dell’unità monomerica designata testa e piede della densità di massa crio-EM (Fig. 6). La struttura TE si adatta bene alla punta della sottostruttura designata piede, mentre il KSI si adatta meglio alla punta della sottostruttura designata testa (Fig. 6). Nel dimero FAS il dominio ACP interagisce sia con il dominio TE dello stesso monomero che con il dominio della chetoacil sintasi nel monomero opposto, portando alla formazione di due centri attivi alle due estremità del dimero. L’orientamento del dominio TE e dell’omologo del dominio KS per il miglior adattamento al piede e alla testa, rispettivamente, accomodava sia lo spazio che l’interazione funzionale della molecola ACP con entrambe le proteine. Quando le strutture sono state scambiate, l’adattamento era molto più povero, con alcune parti di KSI che cadevano fuori dalla densità e un volume più grande di densità non contabilizzata nel fit TE (Fig. 6).
Adattamento preliminare di TE (traccia verde spina dorsale) e KSI (traccia marrone) nel 20-Å risoluzione cryo-EM densità di massa. Le sottostrutture visto dalla densità sono designati Testa, Torso, e piede. La traccia TE si adatta meglio nella sottostruttura designato piede, mentre la traccia KSI spina dorsale adatta è meglio in sottostruttura designato testa. Il miglior adattamento sia per KSI che per TE è cerchiato in rosso. Le tracce della spina dorsale di TE e KSI nella parte inferiore della densità di massa mostrano meno soddisfacente si adatta in testa e piede, rispettivamente. Sulla base di precedenti esperimenti di digestione proteolitica del FAS intatto, sono stati identificati tre domini: il dominio I, che comprende i centri enzimatici KS-AT/MT-DH e la regione del linker; il dominio II, che comprende la regione ER-KR-ACP; e il dominio III, che è assegnato al TE (1, 2). Le sottostrutture Testa e Torso, che sono essenzialmente coalizzate, potrebbero corrispondere al dominio I e a parti del dominio II, e il Piede potrebbe rappresentare il resto del dominio II e del dominio III.
Conclusioni. Le principali conclusioni che possono essere tratte dalla struttura di cristallo del dominio TE del FAS umano sono le seguenti. (i) Il TE è composto da due sottodomini che differiscono per dimensioni e motivi di ripiegamento. (ii) Il sottodominio A più grande presenta un motivo α/β, mentre il sottodominio B più piccolo è tutto elicoidale. (iii) Il sottodominio A contribuisce alla triade catalitica di residui Ser, Asp e His. (iv) Il lungo solco con una tasca distale tra il sottodominio B e parti del sottodominio A costituisce il sito di legame della catena acilica grassa. La geometria e la natura di questo sito sono coerenti con l’alta specificità del TE verso i substrati acilici grassi da C16 a C18. La scanalatura agisce come un righello che misura la lunghezza corretta del substrato. (v) L’adattamento preliminare del TE nella struttura cryo-EM del FAS umano intatto suggerisce una plausibile polarità da N a C delle subunità. Tuttavia, una mappa crio-EM a più alta risoluzione è necessaria per un’ulteriore verifica dell’adattamento e un’analisi approfondita della funzione di FAS.
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