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Overview

I ligandi radioattivi sono comunemente usati per misurare il legame dei ligandi ai recettori. In questo saggio, misurerai il legame di un ligando radiomarcato a cellule o membrane cellulari contenenti un recettore di interesse. Sia le cellule intere che le membrane cellulari possono essere utilizzate per questo test. I radioligandi possono essere usati per eseguire curve di saturazione, competizione ed esperimenti cinetici.

Ligando il recettore

Quando si seleziona un radioligando, ci sono alcuni fattori da tenere in mente:

• Alta attività specifica: I radioligandi con un’alta attività specifica sono adatti ai saggi di legame dei ligandi. L’attività specifica indica quanta radioattività c’è per molecola di ligando, ed è di solito data in unità di Curie per millimole di ligando. Molti dei nostri ligandi marcati con 125I sono offerti alla massima attività specifica (2200 Ci/mmol se è disponibile un sito di marcatura 125I, 4400 Ci/mmol se sono disponibili due siti di marcatura 125I, ecc.) Ciò indica che virtualmente ogni molecola di ligando fornita nella fiala stock è radiomarcata. Per i ligandi triziati (ligandi 3H), dovresti idealmente scegliere un ligando che abbia un’attività specifica superiore a 20 Ci/mmol. La massima attività specifica teorica per trizio è 29 Ci/mmol (Curie per millimole di trizio). Le attività specifiche sopra questo valore indicano che in media, ogni molecola di ligando ha almeno un trizio.
• Basso legame non specifico: I ligandi idrofobici mostreranno generalmente un legame non specifico più alto. Questo può talvolta essere compensato rivestendo i filtri con BSA per ridurre il legame non specifico. Anche l’inclusione di BSA, sali o detergenti nel tampone di lavaggio o di legame può aiutare a ridurre il legame non specifico. Se il radiochimico stock è confezionato in una fiala silanizzata (fare riferimento alla scheda tecnica), questo può indicare che il ligando è in qualche modo idrofobico
• Alta purezza: Idealmente, il ligando dovrebbe avere una purezza radiochimica superiore al 90%. La purezza radiochimica diminuisce nel tempo, e il tasso effettivo di questa degradazione accelera nel tempo. La purezza radiochimica e i tassi di degradazione per i nostri vari prodotti radiochimici possono essere trovati nelle schede tecniche specifiche del lotto.
• Alta selettività: Più selettivo è il ligando per il tuo recettore, migliori saranno i tuoi dati. L’alta selettività indica che il ligando sarà principalmente riconosciuto da un solo recettore di interesse, rispetto ad altri recettori che possono essere presenti in una membrana cellulare. Inoltre, utilizzando membrane che sovraesprimono il recettore di interesse può aiutare a ridurre qualsiasi contributo potenziale da recettori espressi endogenamente nella membrana.
• Stabilità: Se è necessario utilizzare il radioligando per un lungo periodo di tempo, la stabilità può essere un fattore per voi. I ligandi marcati con 125I dovrebbero essere usati generalmente entro uno o due mesi dalla data di produzione. I ligandi triziati dovrebbero essere usati di solito entro 3-6 mesi dalla data di produzione; tuttavia, ci sono eccezioni a questo. I tassi di degradazione e le date di produzione possono essere trovati nelle nostre schede tecniche specifiche del lotto. È inoltre possibile contattare l’assistenza tecnica per discutere il tempo di utilizzo raccomandato per ciascun radiochimico PerkinElmer – le nostre informazioni di contatto si trovano nell’angolo in alto a destra di questa pagina.
• Energia: il 3H rilascia energia beta, che può essere misurata su un contatore a scintillazione dopo l’aggiunta di scintillante (sotto forma di cocktail di scintillazione, scintillante solido Meltilex®, una microsfera SPA, ecc.) L’energia beta interagisce con lo scintillante per produrre fotoni, che vengono misurati dal rilevatore. Il 125I rilascia sia energia beta che energia gamma. Se hai accesso solo a un contatore gamma, dovresti usare un radioligando marcato con 125I. Un ulteriore fattore è il formato del test. Il 125I rilascia più energia beta-simile del 3H. Per i saggi SPA, sia 3H o 125I-etichettati ligandi possono essere utilizzati efficacemente.

I saggi leganti legante radioattivo può essere eseguito è diversi formati. In genere, eseguiamo questo test in formato di filtrazione, ma il test può anche essere eseguito in formato SPA. Il formato SPA è un formato omogeneo, il che significa che non sono necessarie fasi di lavaggio. Nel test di filtrazione, si laverà via il ligando non legato utilizzando un collettore a vuoto o un raccoglitore di cellule.

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Formati di saggio

Saggi di legame del ligando di filtrazione

Vedi maggiori informazioni su quali materiali ti servono, quali ottimizzazioni puoi aver bisogno di eseguire e i riferimenti per i saggi di legame del ligando radioattivo su piastra filtrante. Nel formato di filtrazione, il saggio di legame viene eseguito prima in una piastra di saggio, poi filtrato attraverso un filtermat o una piastra UniFilter® utilizzando un raccoglitore di cellule (collettore a vuoto). I filtri vengono lavati per rimuovere qualsiasi radioligando non legato. La piastra Filtermat o UniFilter viene poi asciugata e viene aggiunto il cocktail di scintillazione (o Meltilex®) prima della lettura in un rivelatore appropriato.

SPA ligand binding assays

Vedi maggiori informazioni su quali materiali ti servono, quali ottimizzazioni potresti dover eseguire e i riferimenti per SPA radioligand binding assays. Nel formato SPA, le membrane cellulari sono catturate su perline SPA. Quando il radioligando si lega al recettore/membrana, questo mette il radiochimico in prossimità della microsfera SPA. L’energia beta del radioligando può interagire con lo scintillante nella microsfera, producendo un segnale che può essere misurato. Il radioligando che non è legato alla membrana cellulare non sarà abbastanza vicino alla microsfera SPA per interagire fortemente con lo scintillante.

Panoramica del legame del ligando

Definizioni

• Affinità (potenza): la tenuta con cui il ligando si lega al recettore. Questo è solitamente espresso come una costante di equilibrio, Kd. Più basso è il valore Kd, più alta è l’affinità.
• Specificità: descrive quanto selettivo è un ligando per un recettore rispetto ad altri recettori simili
• Kd: La concentrazione in cui il 50% dei recettori sono occupati dal radioligando

Classificazioni farmacologiche per i ligandi

Ligandi

• Agonista completo: un ligando che si lega ad un recettore e lo attiva e produce una risposta massima
• Agonista parziale: un ligando che si lega ad un recettore e produce una risposta submassimale
• Antagonista: un ligando che si lega ad un recettore e non lo attiva. Gli antagonisti non innescano alcuna risposta se applicati da soli. Bloccheranno gli effetti di un ligando agonista concorrente.
• Agonista inverso: un ligando che si lega a un recettore e diminuisce la risposta sotto il livello basale

Saggi

I. Esperimento di saturazione: Misura l’equilibrio di legame eseguendo una titolazione del radioligando, mantenendo costante la quantità di recettore.

Puoi usare le curve di saturazione per determinare Bmax (livello di espressione del recettore) e Kd (affinità di legame del ligando).

Saturation experiment

• Binding totale: Aumento della concentrazione di radioligando in assenza di ligando freddo. Misura sia il legame specifico al recettore, sia il legame non specifico.
• Legame non specifico: Aumento della concentrazione di radioligando in presenza di ligando freddo. Misura il legame del radioligando a componenti non recettoriali.
• Legame specifico: Totale meno il legame non specifico. Misura il legame al recettore, in modo specifico.

II. Esperimento di competizione: Misura il legame di equilibrio di una singola concentrazione di radioligando in presenza di varie concentrazioni di un concorrente non marcato.

Puoi usare le curve di competizione per determinare l’affinità di un gran numero di composti non marcati per un recettore in screening. IC50 e Ki possono essere derivati dai dati di competizione.

Curva di competizione

• IC50: concentrazione di un ligando concorrente che sposta la metà del ligando radioattivo
• Ki: affinità di un ligando freddo per il recettore

Nota: quando si cambia la concentrazione del radioligando, si può osservare uno spostamento in IC50 di un composto di riferimento; tuttavia, il Ki rimane lo stesso.

III. Esperimenti cinetici: Misurare il livello di legame in vari momenti per determinare le costanti di velocità per l’associazione e la dissociazione del radioligando.

Kinetics

• Concentrazione saturante di ligando aggiunto una quantità legata nel tempo per determinare la Kon
• Alta concentrazione di concorrente non marcato aggiunto e diminuzione del legame nel tempo misurata per determinare il Koff

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Tips and FAQs

In definitiva, vorrai selezionare un radioligando che abbia le seguenti proprietà:

• Alta attività specifica (> 20 Ci/mmol per un ligando triziato)
• Basso legame non specifico (i ligandi idrofobici mostreranno generalmente un maggiore legame non specifico)
• Alta purezza (tipicamente > puro al 90%)
• Alta selettività
• Stabilità (se dovrai usare il tuo radioligando per un lungo periodo di tempo, la stabilità può essere un fattore. I ligandi marcati con 125I dovrebbero essere usati generalmente entro uno o due mesi dalla data di produzione. Ligandi tritiated dovrebbe essere usato solitamente entro 3-6 mesi dalla data di produzione (tuttavia, ci sono eccezioni a questo).

Quando si tracciano i dati, si consiglia di utilizzare la concentrazione determinata sperimentalmente del vostro radioligando soluzioni di lavoro, piuttosto che una concentrazione calcolata. Alcuni radioligandi si attaccano alle pareti delle provette di diluizione. È importante determinare la vera concentrazione del radioligando pipettato. Per determinare sperimentalmente la concentrazione di una diluizione di radioligandi, pipetta qualche microlitro dalla tua provetta di diluizione e metti in evidenza su un filtro. Potresti anche voler fare una diluizione di 1/10 di questo campione, in modo da poter fare un controllo incrociato dei tuoi risultati. Determina le dpms (disintegrazioni al minuto). Converti da dpms a Curie usando la seguente equazione:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Poi usa l’attività specifica del tuo lotto di radioligando per convertire da Curie a moli. Per determinare la concentrazione radioattiva a questo punto, dividi il numero di moli per il volume che hai messo sul filtro.

FAQs

Q. Quale concentrazione di radioligando dovrei usare per la mia curva di saturazione?
A. Generalmente raccomandiamo di scegliere 3-5 concentrazioni sotto la Kd e 3-5 concentrazioni sopra la Kd. La concentrazione più alta dovrebbe essere dieci volte la Kd.

Q.Quale concentrazione di radioligando dovrebbe essere selezionata per il legame competitivo? Il radioligando è usato ad una bassa concentrazione, di solito al suo valore Kd o inferiore. Se l’attività specifica è bassa, si può usare una concentrazione superiore al valore Kd, ma non deve mai essere pari o superiore alla concentrazione di saturazione.

Q. Che tipo di ligando dovrei usare per determinare il legame non specifico nelle mie curve di saturazione? Di solito vuoi scegliere un ligando che è diverso dal tuo radioligando. Vuoi spostare solo il legame specifico del radioligando al recettore. Dovresti scegliere un ligando che abbia alta affinità per il sito di legame del recettore e bassa affinità per i siti di legame non specifici.

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Altre tecnologie di legame recettore-ligando PerkinElmer

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