PMC

Il sistema nervoso subisce ampi cambiamenti nel patterning, rimodellamento e specificazione cellulare durante lo sviluppo. Nei mammiferi maturi, è costituito da reti di cellule che raggiungono ogni organo e parte del corpo per condurre impulsi avanti e indietro per controllare le risposte fisiologiche essenziali agli stimoli interni ed esterni in modo tempestivo. Per svolgere i suoi compiti, il sistema nervoso utilizza un gran numero di cellule con proprietà diverse per formare strutture estremamente complesse e dipende da una serie di elaborati meccanismi di regolazione genica per il suo sviluppo e la sua funzione. I microRNA (miRNA) sono stati aggiunti come i nuovi attori chiave nella regolazione del sistema nervoso. i miRNA sono una classe di abbondanti RNA lunghi circa 22-nucleotidi endogeni espressi in una vasta gamma di organismi e in ogni tipo di cellula degli organismi. Regolando l’espressione di un gran numero di geni codificanti proteine, i miRNA controllano una varietà di importanti processi biologici (Ambros, 2004). Questa revisione riassume la nostra attuale comprensione dei ruoli dei miRNA nel sistema nervoso dei mammiferi.

miRNA: la biogenesi e i meccanismi di azione. Un miRNA può essere situato all’interno di un introne o esone di un gene ospite o costituire un’unità di trascrizione indipendente (Rodriguez et al., 2004). Viene trascritto inizialmente come parte di un trascritto primario molto più lungo, di solito dalla RNA polimerasi II (Cullen, 2004). Nei mammiferi, il trascritto viene scisso da una RNasi chiamata Drosha, insieme alla sua subunità di regolazione DGCR8, per liberare un precursore hairpin di circa 65 nucleotidi nel nucleo. Un piccolo numero di precursori può anche essere generato in modo indipendente da Drosha (Berezikov et al., 2007; Okamura et al., 2007; Ruby et al., 2007). Il precursore viene poi esportato nel citoplasma da Exportin5 e dal suo cofattore Ran legato al GTP. Una volta nel citoplasma, il precursore viene ulteriormente elaborato da un’altra RNasi, Dicer, per produrre un RNA duplex intermedio di circa 22 coppie di basi. Il legame di una proteina Argonauta al duplex e i conseguenti riarrangiamenti strutturali portano alla ritenzione del miRNA maturo a filamento singolo nel complesso Argonauta: miRNA. Come l’espressione dell’mRNA, l’espressione del miRNA può essere regolata a livello trascrizionale e post-trascrizionale, e alcuni esempi saranno discussi più avanti.

Il complesso Argonaute:miRNA media gli effetti biologici diretti del miRNA attraverso l’interferenza dell’RNA e meccanismi correlati (He e Hannon, 2004). Sono state riportate numerose proteine che interagiscono con la proteina Argonaute, anche se le loro successive funzioni non sono state stabilite con certezza. La frazione di miRNA fornisce chiaramente la specificità al processo di silenziamento dell’RNA legandosi alla sua sequenza bersaglio, solitamente situata nelle regioni 3′ non tradotte di un mRNA animale. La complementarità tra l’estremità 5′ del miRNA, la cosiddetta regione del seme, e l’mRNA target sembra essere sproporzionatamente critica per la specificità del legame, mentre l’estremità 3′ del miRNA contribuisce meno al riconoscimento del target (Lewis et al., 2005). Poiché un miRNA animale non è quasi mai perfettamente abbinato ai suoi bersagli, e le complementarietà parziali sono infatti sufficienti per la funzione del miRNA, un miRNA può regolare l’espressione di centinaia di geni; d’altra parte, un mRNA può contenere più siti di bersaglio di miRNA (Lewis et al., 2005; Xie et al., 2005; Miranda et al., 2006). L’interazione tra un miRNA e il suo mRNA bersaglio porta principalmente alla diminuzione della produzione del prodotto del gene bersaglio (cioè la proteina), anche se il meccanismo dettagliato rimane elusivo (Filipowicz et al., 2008). La proteina Argonaute probabilmente interagisce con il macchinario di traduzione per inibire la sintesi proteica, che potrebbe avvenire in varie fasi (ad esempio, le fasi di iniziazione e di elongazione) durante la traduzione, forse a seconda della natura del miRNA e del trascritto bersaglio. Gli mRNA a cui viene impedita la traduzione spesso mostrano anche un accumulo ridotto. Altri modi di azione sono stati attribuiti ai miRNA. Per esempio, i miRNA possono reprimere l’espressione genica nelle cellule coltivate in ciclo ma aumentare l’espressione genica nelle cellule arrestate (Vasudevan e Steitz, 2007; Vasudevan et al., 2007). Anche se quest’ultima possibilità ha implicazioni significative per i neuroni postmitotici, gli sforzi di ricerca finora si sono concentrati sulla comprensione della repressione genica mediata dai miRNA nei sistemi nervosi.

Ci sono circa 600 geni miRNA umani nell’attuale database dei miRNA, che codificano circa 1000 potenziali miRNA (Griffiths-Jones et al., 2008). Molti di loro sono evolutivamente conservati nei mammiferi, alcuni anche nei vermi e nelle mosche. I geni miRNA sono nominati nell’ordine della loro scoperta, come miR-1, miR-2, ecc, in considerazione della conservazione delle specie, con l’eccezione di lin-4 e let-7, che sono i primi due miRNA mai identificati. Questi approcci, tuttavia, hanno dei caveat. Un piccolo numero di miRNA sono probabilmente mal classificati e rappresentano invece prodotti di degradazione di trascrizioni non correlate (Berezikov et al., 2006a). Inoltre, poiché un miRNA agisce legandosi ai suoi mRNA bersaglio, potenzialmente numerati in centinaia, la funzione di un miRNA dipende criticamente dalla sua massa. Il numero di copie dei miRNA più abbondanti può ben superare i 10.000 per cellula o neurone (Lim et al., 2003; Kye et al., 2007), ma è possibile che alcuni miRNA del database siano espressi a un livello troppo basso per essere efficaci contro la maggior parte dei suoi obiettivi altrimenti potenziali. D’altra parte, anche se un miRNA si trova raramente in un campione totale di tessuto, può ancora essere funzionale se è altamente limitato a una sottopopolazione di cellule di un particolare tipo di cellula o stadio di sviluppo, che può essere rilevante per la situazione nel sistema nervoso.

espressione di miRNA nel sistema nervoso. Come altri tessuti e cellule, anche il sistema nervoso e le linee cellulari neurali esprimono miRNA, alcuni dei quali sono arricchiti o unici nel tessuto e nelle cellule neurali (ad esempio, miR-9, miR-124, miR-125, miR-128 e miR-129) (Lagos-Quintana et al., 2002; Dostie et al, 2003; Babak et al., 2004; Barad et al., 2004; Kim et al., 2004; Liu et al., 2004; Nelson et al., 2004; Sempere et al., 2004; Baskerville e Bartel, 2005; Berezikov et al., 2006b; Hohjoh e Fukushima, 2007a; Landgraf et al., 2007; Bak et al., 2008). Il numero di geni miRNA trovati ad essere espressi nel sistema nervoso sembra essere più grande di quello in molti altri organi, forse in parte riflettendo il fatto che il sistema nervoso contiene molti tipi e sottotipi di cellule. Verso la comprensione della complessità dell’espressione dei miRNA, questi studi hanno ulteriormente rivelato che aree anatomicamente distinte del sistema nervoso centrale adulto (ad esempio, cervelletto, ipotalamo e ippocampo) esprimono miRNA simili, ma i livelli relativi di miRNA possono variare significativamente in diverse regioni.

È stata anche studiata l’espressione dei miRNA durante il differenziamento neuronale e il neurosviluppo. Quando trattate con acido all-trans-retinoico, le cellule di carcinoma embrionale si differenziano in modo terminale in cellule simili ai neuroni. Accompagnata dai cambiamenti morfologici, l’espressione di miRNA come miR-9, miR-124 e miR-125 è significativamente indotta nel tempo, suggerendo che questi miRNA possono avere un ruolo nel differenziamento o nella determinazione del destino cellulare, oltre alle loro potenziali funzioni negli adulti (Sempere et al., 2004; Smirnova et al., 2005; Hohjoh e Fukushima, 2007b). Molti miRNA che non sono specifici per il sistema nervoso sono anche interessati. Per esempio, la famiglia let-7 di miRNA è prominentemente up-regolata, che probabilmente hanno un’influenza più generale sul processo di differenziazione e sviluppo. Cambiamenti simili e profondi nell’espressione dei miRNA sono osservati quando le cellule staminali embrionali subiscono la neurogenesi e la gliogenesi (Smirnova et al., 2005; Krichevsky et al., 2006). Inoltre, miR-124 e miR-128 hanno dimostrato di essere espressi preferenzialmente nei neuroni, mentre miR-23, miR-26 e miR-29 sono limitati o arricchiti negli astrociti (Smirnova et al, 2005). Il profilo di espressione dei miRNA nello sviluppo del sistema nervoso nei mammiferi è stato anche esaminato, e di nuovo, si osserva un’onda temporalmente regolata di espressione dei miRNA (Krichevsky et al., 2003; Miska et al., 2004; Smirnova et al., 2005; Wheeler et al., 2006; Dogini et al., 2008). Tutti questi risultati suggeriscono che il profilo di espressione dei miRNA può servire come marcatore dello sviluppo neuronale e che specifici miRNA possono contribuire al processo di sviluppo.

miRNA sono stati isolati dai polisomi nei neuroni coltivati, coerentemente con il ruolo dei miRNA nel controllo della traduzione (Kim et al., 2004; Nelson et al., 2004). Un aspetto strategico della regolazione genica nelle cellule neurali è che molti mRNA sono concentrati vicino a strutture specifiche per assicurare una sintesi proteica locale e regolata dall’attività. È ipotizzabile che anche alcuni miRNA seguano tali schemi di distribuzione subcellulare. In effetti, l’arricchimento selettivo o l’esaurimento dei miRNA nei dendriti è stato riportato (Schratt et al., 2006; Kye et al., 2007). Questi risultati suggeriscono che i miRNA, come le proteine leganti mRNA specifiche della sequenza, potrebbero regolare l’espressione genica localmente per influenzare la plasticità sinaptica nelle cellule neurali.

Funzione dei miRNA: Lezioni dagli studi sulla perdita globale dei miRNA. I knockout condizionali di Dicer, il gene necessario per la biogenesi dei miRNA, sono stati ampiamente utilizzati per esaminare i ruoli collettivi dei miRNA in tessuti specifici e tipi di cellule nei topi. La perdita di Dicer nelle cellule mature del Purkinje è seguita da una rapida diffusione dei miRNA senza un impatto immediato sulla fisiologia o sulla funzione cellulare (Schaefer et al., 2007). Tuttavia, la morte cellulare alla fine si verifica, portando alla progressiva degenerazione cerebellare e allo sviluppo dell’atassia, che rispecchia i disturbi neurodegenerativi negli esseri umani. L’ablazione di Dicer nei neuroni dopaminergici postmitotici del mesencefalo porta anche a una perdita progressiva dei neuroni in vitro e in vivo, e i topi mutanti hanno una locomozione marcatamente ridotta, reminiscenza dei pazienti con malattia di Parkinson (Kim et al., 2007). Il knockout omozigote di Dicer, a partire dal giorno embrionale 15,5, nella corteccia e nell’ippocampo dei topi provoca cambiamenti nella morfologia dei dendriti, apoptosi, microcefalia, atassia e morte entro 3 settimane dalla nascita (Davis et al., 2008). Topi con perdita Dicer in neuroni dopaminocettivi striatali anche visualizzare fenotipi comportamentali e neuroanatomica, anche se, a differenza di neuroni mirati negli altri studi, i neuroni interessati sopravvivono per tutta la durata della vita degli animali, che è di circa 10 settimane (Cuellar et al., 2008). Dicer è inoltre richiesto per la differenziazione olfattiva nell’embrione, il mantenimento dei progenitori olfattivi e la differenziazione dei precursori olfattivi, mentre è dispensabile per la corretta funzione dei neuroni maturi nei topi (Choi et al., 2008). Una causa sottostante a questi fenotipi può essere che la deplezione di miRNA porta ad una perdita molto graduale di proteine importanti e/o all’accumulo di alcune proteine ad un livello che è alla fine tossico per le cellule. Rimane l’incertezza se alcuni dei fenotipi osservati derivino dalla perdita di funzioni indipendenti dai miRNA di Dicer, perché Dicer processa anche altri piccoli RNA, come i piccoli RNA interferenti. L’aploinsufficienza di DGCR8, un altro gene coinvolto nell’elaborazione dei miRNA, risulta in una ridotta espressione di miRNA e in deficit neuronali e comportamentali anche nei topi (Stark et al., 2008). Nel complesso, si può affermare che le funzioni dei miRNA sono importanti nella differenziazione e nella sopravvivenza neuronale, il che è coerente con l’espressione ubiquitaria dei miRNA e le loro funzioni in altri tessuti: Lezioni dagli studi dei singoli miRNA. Le funzioni dei singoli miRNA nei neuroni in via di sviluppo sono state studiate. Nello stesso studio che ha dimostrato i ruoli combinati dei miRNA nel mantenimento dei neuroni dopaminergici del mesencefalo (Kim et al., 2007), il miR-133b è stato trovato per reprimere la differenziazione di questi neuroni da cellule staminali embrionali e culture del mesencefalo. Gli autori hanno identificato un bersaglio del miR-133b come il fattore di trascrizione Pitx3, che normalmente attiva l’espressione genica nei neuroni dopaminergici. Choi et al. (2008) hanno dimostrato che il miR-200 è essenziale per la differenziazione delle cellule progenitrici olfattive e che la sua funzione può dipendere dalla sua capacità di colpire le vie di segnalazione Notch e transforming growth factor-β e Foxg1. Un altro esempio forse meglio studiato è il miR-124, un miRNA abbondante e caratteristico dei neuroni. L’espressione del miR-124 è bassa nelle cellule staminali embrionali e nelle cellule precursori neuronali, ma aumenta notevolmente nei neuroni. La sovraespressione precoce di miR-124 insieme a un altro miRNA abbondante, miR-9, sposta la differenziazione dei precursori in neuroni, suggerendo che miR-124 e miR-9 stimolano la differenziazione neuronale (Krichevsky et al., 2006). In uno studio separato, la sovraespressione di miR-124 promuove mentre l’inibizione della funzione di miR-124 ritarda la crescita dei neuroni (Yu et al., 2008). miR-124 può conferire proprietà neuronali alle cellule, perché la sovraespressione di miR-124 nelle cellule HeLa down-regola molti geni la cui espressione è assente nei neuroni (Lim et al., 2005), mentre il blocco dell’attività di miR-124 nei neuroni maturi aumenta i livelli di mRNA non neuronali (Conaco et al., 2006). miR-124 svolge le sue funzioni attraverso almeno tre meccanismi. In primo luogo, inibisce l’espressione della piccola fosfatasi del dominio C-terminale 1, un componente del repressore di trascrizione RE1 (Visvanathan et al., 2007). Nei tessuti non neuronali, il repressore di trascrizione RE1-silencing spegne la trascrizione di molti geni neuronali, compreso il miR-124 (Conaco et al., 2006), che è un esempio emergente di fattori di trascrizione critici che regolano l’espressione sia degli mRNA che dei miRNA. Come risultato dell’aumento di miR-124 nei neuroni, la trascrizione di molti geni specifici dei neuroni è indotta. In secondo luogo, miR-124 blocca l’espressione della polypyrimidine tract-binding protein 1, un repressore globale dell’inclusione alternativa degli esoni specifica per i neuroni nelle cellule non neuronali (Makeyev et al., 2007). Così, miR-124 gestisce due regolatori principali per influenzare l’espressione di un ampio spettro di geni. In terzo luogo, miR-124 si rivolge direttamente a molti geni coinvolti nella regolazione del citoscheletro, il che può spiegare la sua funzione nel promuovere la crescita dei neuriti (Yu et al., 2008). miR-124 ha probabilmente anche molti altri obiettivi diretti.

Nei neuroni maturi, la sintesi proteica locale regolata dai miRNA alle sinapsi è un modello interessante per stabilire la plasticità sinaptica. Nei neuroni ippocampali di ratto il miR-134 è concentrato nel compartimento sinaptodendritico (Schratt et al., 2006). La sovraespressione di miR-134 diminuisce significativamente il volume delle spine dendritiche, che approssima la forza sinaptica, mentre l’inibizione della funzione di miR-134 aumenta il volume delle spine. Nei dendriti, il miR-134 impedisce la traduzione della proteina chinasi 1 (Limk1), un regolatore della dinamica dei filamenti di actina. La sovraespressione di Limk1 contrasta gli effetti di miR-134 sulla morfologia delle spine, indicando che l’inibizione dell’espressione di Limk1 è una via principale attraverso la quale miR-134 limita la dimensione delle spine dendritiche. L’interazione funzionale tra Limk1 e miR-134 può essere regolata dalle attività neuronali, perché è alleviata dal fattore neurotrofico derivato dal cervello rilasciato al momento della stimolazione sinaptica attraverso meccanismi ancora da determinare. L’implicazione è che se l’associazione di un miRNA, come quella delle proteine leganti RNA-specifiche, con uno o più mRNA bersaglio è controllata da uno stimolo, allora lo stimolo può modulare l’interazione tra il miRNA e il o i mRNA per regolare l’espressione genica in modo rapido e coordinato. Anche se il miR-134 è finora l’unico miRNA dei mammiferi che ha dimostrato di avere una funzione localizzata nei neuroni, la scoperta che le proteine coinvolte nella biogenesi e nella funzione dei miRNA sono presenti nelle densità postsinaptiche, negli assoni e nei coni di crescita suggerisce che le funzioni specifiche di ulteriori miRNA possono essere identificate in tali luoghi (Lugli et al., 2005; Hengst e Jaffrey, 2007). Accennando a un ruolo dei miRNA nel controllo del rilascio di neurotrasmettitori, è stato riportato che miR-130a e miR-206 inibiscono la sintesi del neurotrasmettitore sostanza P in cellule neuronali umane derivate da cellule staminali mesenchimali, mentre l’interleuchina-1α riduce l’espressione dei miRNA, alleviando così l’inibizione (Greco e Rameshwar, 2007).

L’espressione e la funzione dei miRNA neurali è influenzata da spunti esterni, compresi gli agenti farmacologici. In un modello di coltura di neurosfere derivate dalla corteccia cerebrale fetale del topo per studiare come l’etanolo influenza lo sviluppo del cervello fetale, una dose elevata di etanolo ha dimostrato di sopprimere l’espressione di miR-21, miR-335, miR-9 e miR-153, ma una dose inferiore di etanolo induce miR-335 (Sathyan et al., 2007). Le specie reattive dell’ossigeno alterano l’espressione dei miRNA nelle colture di cellule cerebrali umane (Lukiw e Pogue, 2007), una situazione che può avere rilevanza per la malattia di Alzheimer (Lukiw, 2007). Come esempio di farmaci psicoterapeutici che hanno come bersaglio i miRNA, il litio e il valproato, due importanti stabilizzatori dell’umore, influenzano l’espressione a lungo termine di let-7b, let-7c, miR-128a, miR-24a, miR-30c, miR-34a, miR-221 e miR-144 nell’ippocampo di ratto (Zhou et al., 2008). Le funzioni di questi miRNA devono essere meglio definite. I miRNA potrebbero in parte mediare gli effetti dell’etanolo, delle specie reattive dell’ossigeno o degli stabilizzatori dell’umore sull’espressione genica, e/o potrebbero significare i cambiamenti adattivi nelle cellule cerebrali. Dai miRNA modificati, si possono dedurre e testare i cambiamenti di espressione nei loro geni bersaglio per far luce sui meccanismi di azione di vari agenti e trattamenti. In uno di questi studi, la stimolazione iperosmolare a lungo termine ha dimostrato di aumentare i livelli di miR-7b nell’ipotalamo, e un bersaglio di miR-7b è identificato come Fos, un fattore di trascrizione critico che media le risposte a molti agenti neurofarmacologici (Lee et al., 2006). La trascrizione di miR-132 è controllata positivamente dalla proteina legante l’elemento di risposta cAMP, che, come Fos, risponde a una vasta gamma di stimoli e attività neurali (Vo et al., 2005; Wayman et al., 2008). miR-132 down-regola p250GAP, un membro della famiglia Rac/Rho di proteine attivanti la GTPasi che limita la crescita dei neuriti. La produzione di miR-132 dipendente dalla proteina legante l’elemento di risposta cAMP, guidata dall’attività, si traduce nell’inibizione di p250GAP e nella crescita dei neuriti, contribuendo così alla plasticità dendritica. Un secondo bersaglio del miR-132 è la proteina legante CpG metile 2, un repressore generale della trascrizione (Klein et al., 2007). Inoltre, il miR-132 e un altro miRNA specifico per il cervello, il miR-129, sono controllati dalla luce e dall’orologio circadiano e a loro volta modulano il processo circadiano nel nucleo soprachiasmatico in vivo (Cheng et al., 2007).

Dal corpo di prove in rapida crescita, è chiaro che i miRNA regolano l’espressione dei geni coinvolti in una vasta gamma di processi per influenzare molte fasi e aspetti della maturazione e del funzionamento del sistema nervoso dei mammiferi. Gli studi futuri chiariranno come i miRNA agiscono, di concerto con i fattori di trascrizione, le proteine leganti l’mRNA e altre proteine regolatrici, per regolare finemente l’espressione genica in risposta a stimoli interni ed esterni temporalmente e spazialmente.

Associazione dei miRNA con le malattie neurologiche negli esseri umani. L’espressione e la funzione aberrante dei miRNA è stata implicata nel cancro e in altri disturbi del sistema nervoso. I miRNA sono differenzialmente espressi nel glioblastoma e nel neuroblastoma (Chan et al., 2005; Ciafre et al., 2005; Laneve et al., 2007; Lukiw et al., 2009; Silber et al., 2008). Per esempio, il glioblastoma ha aumentato i livelli di miR-21, miR-221 e miR-222 ma ha diminuito i livelli di miR-7, miR-124 e miR-137. miR-21 è un sospetto oncogene frequentemente sovraespresso nei tumori. I potenziali bersagli di miR-221 e miR-222 includono p27 e p57, inibitori della progressione del ciclo cellulare (Gillies e Lorimer, 2007; Medina et al., 2008), mentre la diminuzione di miR-7 può up-regolare l’espressione del recettore del fattore di crescita epidermico e il percorso Akt (Kefas et al., 2008) e Fos (Lee et al., 2006).

Numerosi studi Dicer knockout hanno rivelato fenotipi murini simili a quelli esibiti nelle malattie neurodegenerative umane (vedi sopra), suggerendo che la perdita di miRNA globali e/o specifici può contribuire alle malattie. Negli esseri umani, è stato identificato un polimorfismo a singolo nucleotide nel sito di legame del miR-189 nella regione 3′ non tradotta dell’mRNA che codifica per un forte gene candidato per la sindrome di Tourette, SLIT e Trk-like 1 (Abelson et al., 2005). Il cambiamento del nucleotide aumenta la repressione genica mediata dal miRNA, secondo un saggio di reporter. L’espressione del miR-133b è carente nel mesencefalo di pazienti con malattia di Parkinson, anche se la relazione causale tra la perdita del miR-133b e la malattia di Parkinson attende di essere determinata (Kim et al., 2007). Un certo numero di miRNA sono trovati differenzialmente espressi nella corteccia prefrontale di pazienti con schizofrenia (Perkins et al., 2007) o nel cervello di pazienti con malattia di Alzheimer (Lukiw, 2007; Lukiw et al., 2008). Per esempio, il miR-146a è elevato nelle cellule cerebrali dei pazienti con malattia di Alzheimer, mentre l’espressione del suo bersaglio putativo, il fattore di complemento H, è depressa. La trascrizione del miR-146a è stimolata dal fattore nucleare-κB (Taganov et al., 2006; Lukiw et al., 2008), il che è coerente con il coinvolgimento delle risposte infiammatorie e di altre risposte di stress nella patogenesi della malattia di Alzheimer. La malattia di Alzheimer è ulteriormente correlata alla perdita di miR-29 e miR-107 del cervello, che normalmente sopprimono l’espressione della β-secretasi (Hebert et al., 2008; Wang et al., 2008). Infine, l’espressione alterata dei miRNA, compresa la riduzione del miR-132, è riportata nei pazienti con la malattia di Huntington (Johnson et al., 2008). Una volta stabilita una correlazione tra l’espressione dei miRNA e i disturbi neurologici, un compito arduo è quello di chiarire il contributo dei miRNA a queste varie malattie.

Intervento terapeutico basato sulla nostra conoscenza dei miRNA. A causa dell’espressione differenziale dei miRNA in varie malattie, si è tentati di sovraesprimere i miRNA o di inibire la funzione dei miRNA per trattare tali disturbi. Anche se i risultati sono ancora preliminari, l’inibizione della funzione di miR-21 ha dimostrato di indurre l’apoptosi nelle cellule di glioblastoma e sensibilizza le cellule alla terapia citotossica del tumore nei topi (Chan et al., 2005; Corsten et al., 2007). La sovraespressione di miR-221 e miR-222 nelle cellule di glioblastoma promuove l’entrata prematura nel ciclo cellulare, portando alla morte cellulare (Medina et al., 2008). Allo stesso modo, la sovraespressione di miR-7 diminuisce la vitalità e l’invasività delle linee primarie di glioblastoma in vitro (Kefas et al., 2008). Questi studi dimostrano che l’espressione differenziale dei miRNA ha conseguenze funzionali e che i miRNA possono servire come bersagli per interventi farmacologici. Per esempio, i miRNA coniugati al colesterolo o i loro inibitori, o i loro vettori di espressione virale, possono essere introdotti per iniezione mirata nel cervello per alterare la funzione dei miRNA. D’altra parte, i farmaci che regolano l’espressione dei miRNA possono essere sviluppati, o una volta che gli effettori a valle dei miRNA sono rivelati, diventeranno anch’essi bersagli farmacologici.

I miRNA artificiali o gli RNA a forcina corta sono stati anche progettati e utilizzati per reprimere l’espressione genica attraverso l’interferenza RNA in modelli di malattia. In questi casi, i miRNA funzionano come piccoli RNA interferenti per colpire i geni virali o i geni endogeni noti per causare malattie. In uno studio, una singola somministrazione intracranica di lentiviral-encoded short hairpin RNA protegge i topi dall’encefalite letale indotta dal virus dell’encefalite giapponese (Kumar et al., 2006). In un altro studio, l’iniezione intracerebellare di virus ricombinanti adeno-associati che esprimono RNA a spirale corta contro l’ataxina-1 mutante, la proteina responsabile della malattia atassia spinocerebellare di tipo 1, ha migliorato la coordinazione motoria, ripristinato la morfologia cerebellare e ridotto le inclusioni nucleari di ataxina-1 in un modello murino di malattia (Xia et al., 2004). Un terzo studio riguarda la malattia di Huntington (McBride et al., 2008), che è causata da una proteina huntingtina mutante dominante. I miRNA artificiali contro la proteina sono codificati da virus ricombinanti adeno-associati e consegnati tramite iniezione nello striato di topi che esprimono la proteina huntingtina umana mutante. I miRNA sono in grado di ridurre l’espressione dell’huntingtina mutante senza causare tossicità apparente nel cervello dei topi.

Perfetto futuro. Non c’è dubbio che la collezione di bersagli miRNA convalidati e funzioni sta per espandersi ad un ritmo sostenuto nel prossimo futuro. Per approfondire la nostra comprensione dei complessi ruoli dei miRNA nella regolazione del sistema nervoso, affrontare una serie di questioni seguenti sarà molto utile. In primo luogo, è possibile raffinare la risoluzione dell’espressione dei miRNA per accogliere i molti diversi tipi e sottotipi di cellule nel sistema nervoso in sviluppo e maturo? Inoltre, la localizzazione subcellulare dei miRNA è dinamica, e la funzione dei miRNA è regolata spazialmente in una cellula neurale? In secondo luogo, si dovrebbe adottare una visione sistemica o globale per valutare come i cambiamenti nell’espressione dei miRNA portino a cambiamenti nell’espressione delle proteine e, in definitiva, a cambiamenti nei fenotipi. Un miRNA ha probabilmente molti obiettivi. Anche se i rapporti pubblicati hanno esaminato, per ogni miRNA, tipicamente solo uno dei suoi bersagli la cui attività è coerente con la funzione globale del miRNA, è altamente probabile che un miRNA possa regolare i geni che controllano sia positivamente che negativamente un particolare processo in vivo. Le azioni dei miRNA sono anche integrate con le azioni di altre molecole regolatrici (per esempio, i fattori di trascrizione). In terzo luogo, gli approcci genetici (per esempio, il knockout condizionato di singoli miRNA) ci daranno risposte più definitive sulle funzioni dei miRNA nel sistema nervoso dei mammiferi. Le analisi genetiche nei vermi, nelle mosche e nel pesce zebra hanno fatto progredire notevolmente la nostra conoscenza dei miRNA e in effetti hanno preannunciato o corroborato molti risultati nel sistema dei mammiferi. Infine, i legami causali tra i miRNA e i disturbi neurologici devono essere stabiliti, e tali informazioni dovrebbero essere utilizzate per ideare nuove strategie terapeutiche.