Results and Discussion
L’attivazione costitutiva del fattore di trascrizione NF-κB è considerata essenziale per la trasformazione delle cellule B da parte della proteina di fusione API2-MALT1 dei linfomi MALT con una traslocazione t(11;18) . La sovraespressione transitoria di API2-MALT1 in cellule 293T provoca la robusta attivazione di un gene reporter NF-κB luciferase, fornendo così un sistema modello utile per studiare i meccanismi attraverso i quali API2-MALT1 segnala a NF-κB. Per monitorare l’efficienza di trasfezione, abbiamo co-espresso pEGFP-N2 (Clontech) in una serie di esperimenti. Con nostra sorpresa abbiamo osservato che EGFP ha inibito l’attivazione di NF-κB indotta da API2-MALT1 in modo dose dipendente (Fig 1A). Al contrario, EGFP non ha influenzato l’attivazione del reporter indotta dall’espressione delle subunità p50/p65 di NF-κB (Fig 1B), suggerendo un’interferenza con la cascata di segnalazione NF-κB attivata da API2-MALT1 a monte di NF-κB.
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(A) L’attivazione di un reporter luciferasico NF-κB da parte di una proteina di fusione API2-MALT1 legata alla bandiera è inibita da EGFP in modo dose dipendente.
(B) EGFP non blocca l’attività luciferasica NF-κB dipendente indotta dall’espressione delle subunità p50/p65 di NF-κB (C) L’attivazione di un reporter luciferasico NF-κB da Flag-API2-MALT1 è inibita da EGFP mutato per il motivo di legame TRAF6 (D) EGFP ma non pmaxGFP impedisce l’attivazione indotta da TNF-α del reporter luciferasi NF-κB e la fosforilazione di IκB-α e JUN in cellule 293T.
EGFP non aumenta i livelli di HSP70 o induce HSP70B′ in cellule 293T.
Le intensità di fluorescenza (Ex485/Em520nm) per EGFP e pmaxGFP erano entrambe ∼100 volte sopra il fondo. (E) Proteine di fusione N- e/o C-terminale EGFP (per API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actina, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) o β-Tubulina) e EGFP con un segnale di localizzazione nucleare (NLS) o un sito di farnissilazione (pEGFP-F) riducono l’attività di reporter di luciferasi NF-κB indotta da TNF-α nelle cellule 293T. In basso: Negli esseri umani, HSP70 è costitutivamente espresso in condizioni normali, ma Hsp70B′ è indotto solo in risposta allo stress.
Non c’è espressione basale di Hsp70B′.
Come controllo positivo per l’espressione di HSP70B′, le cellule 293T (corsia 2) sono state sottoposte a shock termico a 44°C per due ore (corsia 3) e lasciate recuperare a 37°C per 5 (corsia 4) o 18 (corsia 5) ore prima della raccolta. L’attività luciferasica NF-κB-dipendente è rappresentata per ogni esperimento come fold induction delle cellule trasfettate con vettore ed è rappresentata graficamente come media e deviazione standard di almeno tre esperimenti indipendenti.
Tutti gli standard di peso molecolare sono in kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 è un componente essenziale di segnalazione della via antigene-recettore verso NF-κB , . Si ritiene che BCL10 media l’oligomerizzazione di MALT1, che permette la formazione di un complesso con TRAF6. L’oligomerizzazione di TRAF6 suscita l’attività di ubiquitina ligasi E3 del suo dominio RING, con conseguente modifica di IKKγ (NEMO) attraverso catene di poliubiquitina legate a Lys63. Questo facilita poi l’interazione di IKKγ con la chinasi attivante TGFβ 1 (TAK1), che attiva completamente il complesso chinasi IκB (IKK) tramite fosforilazione di IKKβ, portando così all’attivazione di NF-κB. Allo stesso modo, la proteina di fusione API2-MALT1 attiva NF-κB attraverso la poliubiquitinazione mediata da TRAF6 di IKKγ . L’interazione di TRAF6 con il carbossi-terminale di MALT1 avviene attraverso due potenziali motivi di legame TRAF6 (PxExxAr/Ac con Ar/Ac per un residuo aromatico o acido . L’ispezione della sequenza EGFP ha rivelato la presenza di un consenso di legame a TRAF6 (PNEKRD, AA 212-217). La struttura cristallina di EGFP mostra che il motivo PNEKRD è esposto in un ciclo tra due foglietti beta, suggerendo la sua accessibilità e un ruolo per EGFP come regolatore negativo attraverso il sequestro di TRAF6. Tuttavia, gli esperimenti co-IP non sono riusciti a dimostrare un’interazione tra EGFP e TRAF6 (dati non mostrati) e i mutanti per il consenso di legame a TRAF6 hanno bloccato l’attivazione di NF-κB da parte di API2-MALT1 con la stessa efficienza di EGFP (Fig 1C).
Per indagare se l’effetto fosse limitato a API2-MALT1, abbiamo analizzato l’attivazione di NF-κB indotta da TNF-α in cellule 293T che esprimono EGFP. Di nuovo, EGFP ha ridotto la segnalazione di NF-κB come dimostrato da una minore attività del reporter e da una ridotta fosforilazione dell’inibitore di NF-κB, IκB-α (Fig 1D). Successivamente abbiamo valutato se le proteine di fusione EGFP potrebbero avere lo stesso effetto. Entrambe le fusioni EGFP N- e C-terminali hanno bloccato l’attivazione di NF-κB indotta da API2-MALT1- (dati non mostrati) e TNFα (Fig 1E). Oltre ad attivare la via di NF-κB, il trattamento con TNF-α innesca anche la segnalazione di JNK. La fosforilazione di JUN, indicativa per la segnalazione JNK attivata, è ridotta anche da EGFP dopo il trattamento con TNF-α (Fig 1D).
È stato riportato che la visualizzazione prolungata di cellule che esprimono GFP induce la produzione di specie reattive dell’ossigeno, che può portare a cambiamenti fisiologici e infine alla morte cellulare. È interessante notare che entrambi i mutanti EGFP per il consenso di legame TRAF6 avevano perso la loro fluorescenza verde ma inibivano efficacemente la segnalazione NF-κB (Fig 1C). Inoltre, pmaxGFP (Amaxa Biosystems), una proteina fluorescente strutturalmente diversa, non ha avuto effetto sull’attivazione di NF-κB e JNK al trattamento con TNF-α (Fig 1D), suggerendo che l’inibizione non è risultata dalla fototossicità associata ai radicali liberi. Un altro studio ha indicato che alti livelli di EGFP possono indurre la heat shock protein 70 (HSP70), che è in grado di inibire l’attivazione di NF-κB attraverso la sua interazione con IKKγ e TRAF6 . Tuttavia, l’induzione di HSP70 era limitata alle cellule endoteliali e non abbiamo osservato un aumento dei livelli di HSP70 o l’induzione di HSP70B′ nelle cellule 293T che esprimono EGFP (Fig 1D-E).
L’attivazione di NF-κB attraverso l’espressione di API2-MALT1 o al trattamento con TNF-α è associata alla modifica di IKKγ con polubiquitina legata a Lys63 da TRAF6 o TRAF2, rispettivamente. Inoltre la segnalazione di JNK indotta da TNFα richiede l’auto-ubiquitinazione di TRAF2. Per valutare un possibile effetto di EGFP sull’attività dell’ubiquitina ligasi RING E3 di TRAF6 o TRAF2, abbiamo monitorato l’ubiquitinazione tramite un mutante di ubiquitina legato a HA con solo Lys63 disponibile per la polimerizzazione (HA-Ub-K63). L’espressione di API2-MALT1 o la stimolazione di TNF-α ha aumentato il livello di proteine poliubiquitinate nelle cellule 293T ed è stata associata ad una maggiore poliubiquitinazione di IKKγ negli immunoprecipitati, ed entrambi i processi sono stati bloccati da EGFP (Fig 2A, corsie 1,2,5,6). Inoltre EGFP ha ridotto il livello basale di polubiquitinazione legata a K63 nelle cellule 293T (Fig 2A, corsie 3 e 4). Allo stesso modo, l’espressione di API2-MALT1 o il trattamento con TNFα stimola l’assemblaggio della catena di ubiquitina legata a K48, che è di nuovo bloccato da EGFP e dal suo omologo strutturale dsRed (Clontech) ma non da pmaxGFP (Fig 2B).
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(A) cellule 293T trasfettate con i costrutti indicati e trattati per 4 ore con 20 ng/ml TNF-α (corsia 5 e 6) sono stati immunoblottati con anticorpi anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) e anti-EGFP (pannello sinistro) o anti-IKKγ immunoprecipitati sono stati immunoblottati con anti-Flag (IKKγ) o anti-HA (ubiquitina) (pannello destro).
(B) EGFP influenza la poliubiquitinazione legata a K48.
Le cellule 293T sono state trasfettate con un costrutto di Ubiquitina con solo Lys48 disponibile per la polimerizzazione (HA-Ub-K48), trattate per 4 ore con 20 ng/ml TNF-α o lasciate non trattate e i lisati cellulari sono stati immunoblottati con anticorpi anti-HA (Ub-K48) e anti-EGFP.
Le intensità di fluorescenza (eccitazione 485/emissione 520 nm) per EGFP e pmaxGFP erano paragonabili (∼100 volte superiori ai valori di fondo), l’espressione di pDs-Red è stata confermata dalla microscopia a fluorescenza.
(C) EGFP stabilizza l’API2-Myc esogeno nelle cellule 293T attraverso la riduzione della sua auto-ubiquitinazione legata a Lys48 e la degradazione proteasomale.
(D) L’espressione stabile di EGFP nella linea cellulare di carcinoma merkel MCC14.2 riduce la poliubiquitinazione e aumenta i livelli di espressione di p53 endogena.
Il rapporto medio e la deviazione standard dei segnali p53 e actina sono dati (tre esperimenti indipendenti), (Ub)n : proteine poliubiquitinate.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Per indagare se EGFP colpisce esclusivamente l’ubiquitinazione dalle proteine TRAF, abbiamo valutato API2, una ligasi RING E3 ubiquitina che si destabilizza tramite auto-ubiquitinazione legata a Lys48. La coespressione di EGFP ha inibito la poliubiquitinazione indotta da API2 nelle cellule 293T con conseguente aumento dei livelli di espressione di API2 (Fig 2C). Ridotti livelli di stato stazionario di ubiquitinazione sono stati osservati anche nelle cellule MCC14.2 con espressione stabile di EGFP. Di conseguenza, i livelli basali di p53 endogeno, che sono strettamente regolati attraverso l’ubiquitinazione legata a Lys48 da MDM2, sono leggermente aumentati nelle cellule che esprimono EGFP (Fig 2D).
In seguito abbiamo esaminato se EGFP influenza l’ubiquitinazione in vivo. I livelli basali di poliubiquitinazione sono stati ridotti nei linfociti splenici di topi transgenici EGFP, il che è stato associato a una ridotta fosforilazione di IκB-α dopo la stimolazione dell’antigene rispetto ai topi di controllo, indicando che EGFP riduce l’attivazione di NF-κB indotta dal recettore delle cellule B (Fig 3A-B). I topi transgenici API2-MALT1 hanno un deficit di cellule B B220+/CD40+ nel loro midollo osseo poiché l’attivazione NF-κB mediata da API2-MALT1 accelera la loro maturazione in cellule B ingenue. Quando questi topi transgenici API2-MALT1 sono stati incrociati con topi EGFP, il deficit di B220 + / CD40 + cellule B nel midollo osseo di EGFP / API2-MALT1 doppio transgenico (Fig 3C) è stato ripristinato, sostenendo ulteriormente un impatto sulla ubiquitinazione e NF-κB segnalazione in vivo. Allo stesso modo, la poliubiquitinazione è stata ridotta nelle cellule epatiche dei topi EGFP ed è stata associata alla stabilizzazione di p53 come mostrato dall’aumento del suo livello di espressione (Fig 3A, D). Il principale gene bersaglio di p53 su danni al DNA indotti da γ-irradiazione nel fegato è p21, che è richiesto per l’arresto del ciclo cellulare e la riparazione del DNA. Di conseguenza, il danno al DNA indotto da γ-irradiazione ha causato non solo una maggiore risposta di p53 nei topi EGFP, ma anche l’induzione di p21 è stata leggermente migliorata (Fig 3D). Infine sono stati eseguiti esperimenti in vitro per valutare se EGFP influenza direttamente l’assemblaggio della catena di ubiquitina; tuttavia EGFP ricombinante non ha influenzato la poliubiquitinazione di un substrato di controllo (Fig 3E), suggerendo un effetto dipendente dal contesto cellulare di EGFP sull’ubiquitinazione.
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(A) Western blot di estratti di milza e fegato da FVB wild-type (wt) e topi transgenici EGFP rilevato con anticorpi contro Ubiquitina, EGFP e actina (controllo di carico).
(B) EGFP riduce la fosforilazione di IκB-α in linfociti B stimolati con anti-IgM/anti-CD40 purificati da topi EGFP.
Esperimenti eseguiti in triplicato, è mostrata un’immagine rappresentativa di un esperimento.
Sono indicate la media e le deviazioni standard dei rapporti tra IκB-α-P e actina rispetto alle cellule non stimolate.
(C) Il deficit di cellule B B220+/CD40+ nel midollo osseo dei topi API2-MALT1 è ripristinato nei topi transgenici EGFP/API2-MALT1 doppi.
Esperimenti eseguiti in triplicato, la media e le deviazioni standard sono indicate. eMalt1: Malt1 endogeno, banda *a-specifica (D) I topi EGFP mostrano un aumento dei livelli di p53 nel fegato e hanno potenziato le risposte p53/p21 su danni al DNA indotti da γ-irradiazione.
Sono date la media e le deviazioni standard dei rapporti dei segnali p53/p21 rispetto all’actina rispetto a quello del campione 1.
(E) EGFP ricombinante (rEGFP) non impedisce la poliubiquitinazione di un substrato di biotina-lisozima in vitro. (Ub)n: proteine polubiquitinate.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
In conclusione, i nostri dati indicano che le proteine di fusione EGFP e EGFP influenzano i processi RING E3 ubiquitin ligase-dipendenti come la segnalazione di NF-κB e JNK o l’omeostasi di p53 in linee cellulari e nei topi. NF-κB gioca un ruolo centrale nella regolazione di diversi processi biologici, tra cui l’immunità innata e adattativa, lo sviluppo, la crescita cellulare e la sopravvivenza. I segnali pro-sopravvivenza derivano dall’elevata espressione degli inibitori dell’apoptosi, come la leucemia/linfoma a cellule B-XL. Pertanto, l’aumento dell’apoptosi indotta da EGFP nelle cellule o nella corteccia motoria e nello striato del cervello dei topi potrebbe essere legato ad una ridotta attività di NF-κB dovuta ad una difettosa poliubiquitinazione e attivazione/degradazione dei suoi regolatori a monte. L’ubiquitinazione difettosa è anche postulata per causare la distrofia muscolare della cintura degli arti, che è associata a mutazioni in Trim32, una ligasi dell’ubiquitina per l’actina. Poiché EGFP ha dimostrato di compromettere le interazioni actina-miosina nelle cellule muscolari e di indurre una cardiomiopatia dilatata nei topi EGFP, si è tentati di ipotizzare che l’ubiquitinazione dell’actina potrebbe svolgere un ruolo essenziale nel normale funzionamento del muscolo e che la sua deregolazione da EGFP causa i fenotipi sopra menzionati. Pertanto, in considerazione del ruolo emergente dell’ubiquitinazione in numerosi processi cellulari, l’uso di EGFP come reporter di cellule vive dovrebbe essere considerato con attenzione.
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