Nucleolo

Il nucleolo è contenuto all’interno del nucleo cellulare.

Il nucleolo (nucleoli plurali) è un grande, distinto, sottocompartimento sferoidale del nucleo delle cellule eucariote che è il sito di sintesi dell’RNA ribosomiale (rRNA) e di assemblaggio delle subunità ribosomiali. Un nucleolo a volte è indicato come un “organello non membranoso” o “organello nucleare senza membrana” nel senso più ampio del termine organello; tuttavia, i nucleoli mancano di una membrana e quindi non sono organelli nel senso più tecnico di strutture che sono separatamente racchiuse all’interno della propria membrana lipidica. La maggior parte delle cellule vegetali e animali hanno uno o più nucleoli, ma alcuni tipi di cellule non ne hanno nessuno.

Il nucleolo è una struttura altamente dinamica i cui componenti vengono dispersi all’inizio della mitosi e riassemblati alla fine della divisione cellulare. Questo intricato corpo lavora in cooperazione con altri componenti nucleari per fornire una preziosa funzione alla cellula. Tuttavia, quando questa complessa coordinazione nelle cellule umane è interrotta, come per esempio da un’infezione virale, da mutazioni congenite o da un aumento dell’attività, possono risultare diverse malattie umane.

Panoramica

Schema della tipica cellula animale, che mostra i componenti subcellulari. Organelli:
(1) nucleolo
(2) nucleo
(3) ribosomi (puntini)
(4) vescicola
(5) reticolo endoplasmatico ruvido (ER)
(6) apparato di Golgi
(7) citoscheletro
(8) reticolo endoplasmatico liscio (ER)
(9) mitocondri
(10) vacuolo
(11) citoplasma
(12) lisosoma
(13) centrioli all’interno del centrosoma

Il nucleolo è una grande e distinta struttura nucleare che è altamente organizzata e non ha una membrana. La funzione principale del nucleolo è la biogenesi e l’assemblaggio dei componenti del ribosoma (rRNA, proteine ribosomiali). Questo sito di trascrizione del DNA ribosomiale (rDNA) è stato definito una “macchina che produce ribosomi” (Alberts et al. 1989). Il nucleolo può essere visualizzato attraverso la microscopia elettronica, mentre l’organizzazione e la dinamica possono essere studiate attraverso il Fluorescent Protein Tagging e il Fluorescent Recovery after Photobleaching (FRAP).

In una cellula non mitotica, osservata al microscopio ottico, il nucleolo è la struttura più evidente nel nucleo (Alberts et al. 1989). Tuttavia, durante le fasi iniziali della divisione cellulare, i nucleoli sono frammentati (non possono più essere visti in metafase). Alla transizione tra la telofase e l’interfase, essi si riassemblano intorno alle regioni della cromatina dove la trascrizione dell’rDNA viene reiniziata. Le sequenze di rDNA codificano le molecole di rRNA (RNA ribosomiale) dei ribosomi.

Invece di essere legato da una membrana, il nucleolo sembra essere costruito dal legame specifico di precursori di ribosomi non finiti, formando una grande rete (Alberts et al. 2004). Si possono distinguere tre regioni di un nucleolo: un centro fibrillare (che contiene DNA non attivamente trascritto), una componente fibrillare densa (contiene molecole di RNA in fase di trascrizione), e una componente granulare (contiene particelle di precursori ribosomiali in via di maturazione) (Alberts et al. 1989). Quest’ultima regione aiuta a rendere distinto il confine con il nucleoplasma circostante, nonostante la mancanza di una membrana.

Poiché i nucleoli svolgono la produzione e la maturazione dei ribosomi, al loro interno si trova un gran numero di ribosomi. Oltre alla biogenesi dei ribosomi, si ritiene che i nucleoli abbiano altri ruoli nell’attività cellulare. Inoltre, secondo una recente ricerca, il nucleolo è anche responsabile del traffico di varie specie di piccoli RNA importanti. Il nucleolo li aiuta durante il loro processo di maturazione e il percorso verso la loro destinazione cellulare finale. Inoltre, anche se i nucleoli diventano invisibili durante la divisione cellulare, studi recenti hanno scoperto che sono coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare. Molti dei suoi ruoli non tradizionali includono l’interazione con componenti virali, la regolazione delle attività dei soppressori tumorali e degli oncogeni, l’assemblaggio delle particelle di riconoscimento dei segnali, la modifica dei piccoli filamenti di RNA, il controllo dell’invecchiamento e la modulazione della funzione della telomerasi.

I primi citologi erano così interessati ai nucleoli facilmente visibili che una revisione del 1898 elencava circa 700 riferimenti (Alberts et al. 1989). I citologi dimostrarono nel 1940 che i nucleoli contengono alte concentrazioni di RNA e proteine (Alberts et al. 1989). Nel 1964, John Gurdon e Donald Brown scoprirono i nucleoli cellulari nella rana africana artigliata Xenopus laevis. Hanno scoperto che il 25% delle uova di rana non aveva nucleoli e che tali uova non erano in grado di vivere. La metà delle uova aveva un nucleolo e il 25% ne aveva due. Conclusero che il nucleolo aveva una funzione necessaria per la vita. Nel 1966 Max L. Birnstiel e Hugh Wallace dimostrarono con esperimenti di ibridazione che i nucleoli codificano per il DNA ribosomiale.

Morfologia del nucleolo

I nucleoli sono tipicamente composti da tre regioni morfologicamente distinte, che possono essere visualizzate al microscopio elettronico (EM) (Hernandez-Verdun 2006a; 2006b; Olson e Dundr 2005; Raška et al. 2006; Thiry e Lafontaine 2005):

1. Centro fibrillare (FC):

• poco colorato quando osservato con EM
• composto da “fibrille” (± 50Ǻ in Ø)
• presenza di pol I e UBF
• molti FC in un nucleolo
• rappresenta solo l’1-2% del volume totale del nucleolo

2. Dense Fibrillar Center o Dense Fibrillar Component (DFC):

• circondano le FC
• composte da “fibrille densamente imballate” (30-50 Ǻ in Ø)
• occupano una grande frazione del nucleolo, ± 17% e riflettono approssimativamente l’impegno nucleolare nella biogenesi dei ribosomi

3. Regione granulare o componente granulare (GR):

• regione che comprende sia la FC che la DFC
• costituita da granuli 150-200 Ǻ in Ø
• regione ricca di granuli per la presenza di particelle RNP
• con una frazione di circa il 75 per cento, occupa la frazione maggiore del volume totale del nucleolo
• anche se il nucleolo non è legato alla membrana, a causa della presenza di GC, il confine con la cromatina e il nucleoplasma circostante è solitamente distinto.

Un componente sostanziale (aggiuntivo) del nucleolo è la cromatina, che penetra nell’organello dal nucleoplasma circostante.

Un collegamento continuo tra il nucleoplasma e le parti interne del nucleolo esiste attraverso una rete di canali nucleolari. In questo modo, macromolecole con un peso molecolare fino a 2000 kDa sono facilmente distribuite in tutto il nucleolo.

Un’ultima struttura è identificata all’interno del nucleolo e viene chiamata vacuolo nucleolare. Ci sono più vacuoli nucleolari nel nucleolo, ma non è chiaro se servano o meno a qualche scopo funzionale o strutturale.

Anche se l’organizzazione “tripartita” (FC, DFC, GC) del nucleolo è comunemente accettata, è stato proposto che questa particolare organizzazione sia osservata solo negli eucarioti superiori e che si sia evoluta da un’organizzazione bipartita con la transizione dagli anamnioti agli amnioti. Riflettendo il sostanziale aumento della regione intergenica dell’rDNA, una componente fibrillare originale si sarebbe separata nella FC e nella DFC (Thiry e Lafontaine 2005).

Il nucleolo e la trascrizione dell’rDNA/elaborazione dell’rRNA/assemblaggio del ribosoma

L’assemblaggio del nucleolo avviene in modo non casuale. I nucleoli si formano intorno a specifici loci genetici chiamati regioni organizzatrici nucleari (NOR). Precedentemente descritto da McClintock come “elemento organizzatore nucleolare”, un NOR è composto da ripetizioni in tandem di geni rRNA che sono presenti in più copie in tutto il genoma. Il genoma umano, per esempio, contiene più di 200 copie del gene dell’rRNA e sono raggruppate su cinque diversi cromosomi. In un tipico eucariote, un gene rRNA consiste in un promotore, spaziatori trascritti interni ed esterni (ITS/ETS), sequenze codificanti l’rRNA (18S, 5,8S, 28S), e uno spaziatore esterno “non” trascritto (Alberts et al. 2002).

Nella biogenesi dei ribosomi, sono necessarie tre RNA polimerasi eucariotiche (pol I, II, III) che funzionano in modo coordinato. In una fase iniziale, i geni dell’rRNA sono trascritti come una singola unità all’interno del nucleolo da RNA pol I. Affinché questa trascrizione avvenga, sono necessari diversi fattori associati a pol I e fattori di trascrizione specifici per l’rDNA. Nel lievito, i più importanti sono UAF (upstream activating factor), TBP (tata-box binding protein), e CF (core factor), che legano elementi del promotore e formano il complesso di preiniziazione (PIC), che è a sua volta riconosciuto da pol I.

Negli esseri umani, un PIC simile è assemblato con SLI, il fattore di selettività del promotore, che è composto da TBP e fattori associati a TBP (TAF), IF, il fattore di iniziazione della trascrizione, e UBF, fattore di legame a monte.

La trascrizione del gene ribosomiale produce una lunga molecola precursore (45S pre-rRNA), che contiene ancora il sapcer interno trascritto (ITS) ed esterno trascritto spaziato (ETS). Un’ulteriore elaborazione, che coinvolge la metilazione e l’attività endo/esonucleasica, è quindi necessaria per generare le molecole 18S rRNA, 5,8S e 28S rRNA. Gli enzimi che modificano l’RNA sono portati ai loro rispettivi siti di riconoscimento attraverso l’interazione con gli RNA guida, che legano queste sequenze specifiche. Gli RNA guida appartengono alla classe dei piccoli RNA nucleolari (snoRNA), che sono complessati con le proteine ed esistono come piccole particelle nucleolari-ribonucleoproteiche (RNP) (snoRNP).

Una volta elaborato l’rRNA, le molecole di rRNA sono pronte per essere assemblate nei ribosomi. Tuttavia, un’ulteriore molecola di RNA, il 5S rRNA, è necessaria per questa biogenesi. Nel lievito, la sequenza di 5S rDNA è localizzata nello spaziatore esterno “non” trascritto e viene trascritta nel nucleolo da RNA pol III. Negli eucarioti superiori e nelle piante, la situazione è più complessa, poiché la sequenza 5S rDNA si trova all’esterno del NOR e viene trascritta nel nucleoplasma, dopo di che viene importata nel nucleolo per partecipare all’assemblaggio del ribosoma. Questo assemblaggio non coinvolge solo l’rRNA, ma anche le proteine ribosomiali. I geni che codificano queste proteine r sono trascritti da pol II nel nucleoplasma attraverso una via “convenzionale” di sintesi proteica (trascrizione, elaborazione del pre-mRNA, esportazione nucleare dell’mRNA maturo e traduzione sui ribosomi citoplasmatici). Le proteine r mature sono poi reimportate nel nucleolo. L’associazione e la maturazione degli rRNA e delle proteine r portano alla formazione delle subunità 40S e 60S del ribosoma. Queste vengono esportate attraverso i complessi dei pori nucleari nel citoplasma dove rimangono libere o si associano al reticolo endoplasmatico (Alberts et al. 2002; Cooper e Hausman 2007).

Organizzazione e dinamica nucleolare

Molte proteine nucleolari e piccoli RNA nucleolari (snoRNA) si associano per formare il macchinario di elaborazione richiesto nella biogenesi del ribosoma. Sono coinvolti nella modifica dei trascritti nascenti dell’rRNA attraverso la metilazione (2′-O-metilazione/pseudouridilazione) e la scissione endonucleolitica dei pre-RNA. Questi stadi di elaborazione sono principalmente confinati nella DFC (componente fibrillare densa) come rivelato dalla presenza di queste snoRNP (piccole particelle nucleari-ribonucleoproteiche) che costituiscono proteine, per esempio la fibrillarina, la nucleolina e lo snoRNA U3. Le proteine B23 e NOP52, coinvolte nelle fasi successive dell’elaborazione, sono localizzate nella GC (componente granulare).

Questo dimostra che l’organizzazione dei nucleoli è altamente regolata e dipendente dalle fasi di elaborazione dell’rRNA. Queste osservazioni hanno anche portato all’ipotesi che la trascrizione dell’rDNA deve avvenire nel FC (centro fibrillare) o alla giunzione tra il FC e il DFC a causa del movimento vettoriale verso l’esterno dei trascritti pre-RNA mentre vengono elaborati per produrre gli rRNA maturi.

Se si considera l’insieme completo delle proteine e degli RNA necessari nella biogenesi del ribosoma, si può supporre che un nucleolo si formi semplicemente perché alcune proteine, coinvolte nella trascrizione dei geni dell’rDNA, si legano alle loro regioni bersaglio, e che tutto intorno ad esse ci sia un assemblaggio spontaneo di tutti gli elementi coinvolti nella modifica degli rRNA nascenti. Pertanto, l’organizzazione avviene come conseguenza della biogenesi del ribosoma.

Sono stati utilizzati diversi approcci sperimentali per ottenere una visione dettagliata di questo particolare processo di assemblaggio. I più importanti sono il Fluorescent Protein Tagging, in cui una proteina di interesse viene fusa con una proteina fluorescente come la “green fluorescent protein” (GFP) e il Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) che consiste nel taggare una proteina con una proteina di fusione dopo di che le molecole fluorescenti nell’area di studio vengono sbiancate con un laser. L’intensità fluorescente dell’area in studio si riprende a causa della diffusione verso l’esterno delle molecole sbiancate e della diffusione verso l’interno delle molecole non sbiancate. Il primo approccio permette di tenere traccia del movimento del complesso fluorescente (3D+tempo) e il secondo permette di misurare il tempo di residenza (tempo trascorso in una certa area) della proteina fluorescente (in altre parole, misurare la mobilità intracellulare).

Entrambi i metodi sperimentali si basano sulla capacità di etichettare un’intera gamma di proteine associate al nucleolo come le proteine nucleolari, gli istoni, le proteine di legame al DNA, i fattori di trascrizione e gli spliceosomi. Tracciare e misurare il tempo di residenza delle proteine etichettate ha permesso di dimostrare i rapidi tassi di associazione/dissociazione delle proteine nucleolari con altri componenti nucleolari, il continuo scambio di proteine tra il nucleolo e il nucleoplasma durante l’interfase, e il coinvolgimento di queste proteine nucleolari con altri domini nucleari. Per esempio è stato scoperto che i corpi di Cajal (CB) sono arricchiti in piccole ribonucleoproteine nucleari e nucleari e che contengono diverse proteine di elaborazione associate al nucleo, come la fibrillarina. Pertanto è stato proposto che esista una relazione funzionale tra nucleoli e corpi di Cajal (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Diverse osservazioni sperimentali indicano che il reclutamento degli elementi costitutivi del nucleolo avviene in modo non casuale e che è regolato dalla progressione del ciclo cellulare. Durante la mitosi, il macchinario di trascrizione rimane strettamente associato all’rDNA. Tuttavia, la trascrizione è repressa dal complesso proteico chinasi ciclina B/Cdk1 (PMF). Questo complesso è attivato all’inizio della mitosi e reprime le attività nucleari fosforilando un certo numero di protein chinasi o proteine strutturali coinvolte nei riarrangiamenti cellulari necessari per una corretta divisione cellulare. È alla fine della mitosi, quando il PMF viene degradato attraverso la scissione proteolitica della ciclina B, che i nucleoli si riassemblano intorno ai siti dell’rDNA in risposta al reinizio della trascrizione dell’rDNA. Le proteine nucleolari sono, in contrasto con le proteine coinvolte nella trascrizione, localizzate alla periferia dei cromosomi durante la fase M del ciclo cellulare. Questo può essere visualizzato tramite la marcatura con proteine fluorescenti. Alla transizione della telofase a G1, la maggior parte di essi si raggruppa in Corpi Prenucleolari (PNB). Sono questi PNB che effettuano la traslocazione dai cromosomi ai siti in cui è iniziata la trascrizione dell’rDNA. Si pensa che i PNB funzionino come piattaforma di assemblaggio e come serbatoio per i complessi proteici, che rilasciano le proteine di elaborazione nei siti di trascrizione dell’rDNA. Le proteine di elaborazione precoce, come la fibrillarina, sono reclutate in risposta a una diminuzione dell’attività della ciclina B/Cdk1, mentre le proteine di elaborazione tardiva, come B23 e Nop52, sono reclutate in risposta all’attività della chinasi ciclina dipendente (cdk). In questo modo, le varie proteine di elaborazione possono essere rilasciate esattamente nel momento in cui sono necessarie durante la sintesi dell’rRNA (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b).

Malattie umane associate al nucleolo

Le malattie umane associate a un malfunzionamento del nucleolo possono essere causate da infezioni virali, da un aumento dell’attività nucleolare o semplicemente da mutazioni congenite che colpiscono le proteine nucleolari.

Se un virus contiene un segnale di targeting nucleolare (NOS) nel suo genoma, qualche particella virale sarà diretta verso il nucleolo. È il caso del virus dell’immunodeficienza umana (HIV), che dirige la proteina HIV-1 Rev verso il nucleolo. Attraverso l’interazione con la proteina nucleolare B23, serve il suo scopo regolando il modello di splicing dell’mRNA dell’HIV-1, poiché promuove l’esportazione dell’mRNA non splicitato nel citoplasma. È stato proposto che la proteina Rev sia localizzata nel nucleolo per fornire una via di traslocazione alternativa per l’mRNA virale (non spliced/parzialmente spliced) dal nucleoplasma al citoplasma. In questo modo, l’mRNA virale è protetto dalla degradazione (che normalmente avrebbe luogo per proteggere la cellula dalla traduzione del pre(non processato)-mRNA).

Un’aumentata attività nucleolare avrà un effetto sulla sovrapproduzione di ribosomi, che alla fine porterà alla tumorgenesi e al cancro. Un fattore chiave in questi nucleoli disfunzionali è la proteina c-myc, prodotto del c-myc-proto-oncogene. Essa stimola la biogenesi dei ribosomi regolando direttamente la pol I, influenzando la trascrizione della pol II, III e associandosi al componente SL1 del complesso di preiniziazione, che aumenta l’efficienza del reclutamento della pol I al complesso di preiniziazione.

Inoltre, sono state descritte diverse mutazioni congenite che interessano le proteine nucleolari: Sindrome di Weine, sindrome di Treacher Collins e sindrome discheratosica congenita (Hernandez-Verdun 2006a, 2006b; Raška et al. 2006).

Dominanza nucleolare

La dominanza nucleolare è stata dimostrata anche per i geni rRNA. In alcuni organismi, in particolare le piante, quando due nuclei sono combinati in una singola cellula durante l’ibridazione, l’organismo in via di sviluppo può “scegliere” un set di geni rRNA per la trascrizione. I geni dell’rRNA dell’altro genitore sono soppressi e generalmente non trascritti, anche se occasionalmente può verificarsi la riattivazione dei geni dell’rRNA soppressi o “inferiori”. Questa preferenza selettiva della trascrizione dei geni rRNA è definita dominanza nucleolare.

• Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and J. D. Watson. Molecular Biology of the Cell, 2a edizione. New York: Garland Publishing, 1989. ISBN 0824036956.

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• Thiry, M., and G. Goessens. 1996. Il Nucleolo durante il ciclo cellulare. New York: Springer; Austin, TX: R.G. Landes. ISBN 3540613528.

Tutti i link recuperati il 14 dicembre 2018.

• Nucleolo al microscopio elettronico II.

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