La doxiciclina è antinfiammatoria e inibisce l’esotossina stafilococcica.indotta da citochine e chemochine

La tossina 1 della sindrome da shock tossico dello stafilococco (TSST-1) e le esotossine strutturalmente correlate sono esotossine batteriche che si legano direttamente alle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II sulle cellule presentanti l’antigene (1, 5, 8, 18, 23) e attivano le cellule T che esprimono elementi Vβ specifici (7). Queste tossine sono chiamate superantigeni a causa della loro capacità di stimolare policlonalmente grandi popolazioni di cellule T (1, 4, 7, 14). Così, le esotossine stafilococciche (SE) sono potenti attivatori del sistema immunitario e causano una varietà di malattie negli esseri umani, tra cui intossicazione alimentare, shock tossico e malattie autoimmuni (1, 2, 6, 12, 14, 22). Le loro interazioni con le cellule del sistema immunitario provocano una massiccia produzione di citochine e chemochine proinfiammatorie (1, 4, 15, 17). Le citochine fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), interleuchina-1 (IL-1) e interferone gamma (IFN-γ) sono mediatori chiave nello shock tossico indotto dal superantigene (1, 21). Sia il TNF-α che l’IL-1 hanno potenti attività immunostimolanti e agiscono sinergicamente con l’IFN-γ per aumentare le reazioni immunitarie e promuovere il danno tissutale (16). Di conseguenza, queste citochine sono patogene ad alte concentrazioni in vivo e sono responsabili della febbre e dello shock tossico indotto da SE (13, 14, 18, 19).

La doxiciclina è un antibiotico ad ampio spettro ampiamente utilizzato per le infezioni causate da microorganismi gram-negativi e gram-positivi. Agisce come un agente batteriostatico ed è altamente efficace contro molti microrganismi, tra cui Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis e Yersinia pestis. La doxiciclina appartiene alla famiglia degli antibiotici tetraciclini, i cui membri hanno dimostrato di avere altre azioni biologiche indipendenti dai loro effetti antimicrobici (10). La doxiciclina inibisce la metalloproteinasi 8 (MMP-8) e la MMP-9 mediate dal phorbol-12-myristate-13-acetato nelle cellule endoteliali umane (11). La doxiciclina diminuisce anche la degradazione dell’elastina e riduce l’attività delle MMP in un modello di malattia aneurismatica (3). Più recentemente, la doxiciclina ha dimostrato di inibire la produzione di IL-1β in colture epiteliali corneali trattate con lipopolisaccaridi in una misura paragonabile a quella raggiunta dai corticosteroidi (25). In vivo, la doxiciclina ha protetto i topi dall’endotossemia letale abbassando la secrezione di citochine e nitrati nel sangue (20). Questo studio è stato intrapreso per determinare l’effetto modulatore della doxiciclina sull’attivazione delle cellule T indotta dal superantigene stafilococcico e la produzione di citochine dalle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC).

Le PBMC umane sono state isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità Ficoll-Hypaque di sangue eparinizzato da donatori umani normali. Le PBMC (106/ml) sono state coltivate a 37°C in piastre da 24 pozzetti contenenti RPMI 1640 medium e 10% di siero fetale bovino inattivato al calore. Le cellule sono state incubate con SEB (200 ng/ml) o TSST-1 (200 ng/ml) per 16 ore, e i surnatanti sono stati raccolti e analizzati per IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α, e MIP-1β. Le citochine e le chemochine sono state misurate mediante un test immunosorbente legato ad un enzima con anticorpi specifici per citochine o chemochine secondo le istruzioni del produttore (15, 17). Citochine e chemochine umane ricombinanti (da 20 a 1.000 pg/ml) sono state usate come standard per la calibrazione su ogni piastra. Il limite di rilevamento di ogni test era di 20 pg/ml. I dati delle citochine e delle chemochine sono stati espressi come lettura media ± la deviazione standard (SD) di campioni duplicati. La doxiciclina, quando presente, è stata aggiunta contemporaneamente all’agente stimolante. La citotossicità è stata misurata dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) dal citosol nel surnatante della cultura. La LDH è stata quantificata utilizzando un kit colorimetrico per il saggio di citotossicità (Boehringer Mannheim) come indicato dal produttore. La quantità massima di LDH rilasciabile (100%) è stata ottenuta lisando le cellule con 1% Triton X-100. La proliferazione delle cellule T è stata valutata con PBMC (105/pozzetti), che sono state piastrate in triplicato con SEB o TSST-1 (200 ng/ml), con o senza doxiciclina, per 48 ore a 37°C in piastre da 96 pozzetti. Le cellule sono state pulsate con 1 μCi di timidina (New England Nuclear, Boston, Mass.) per pozzetto durante le ultime 5 h di cultura come descritto in precedenza (15). Le cellule sono state raccolte su filtri in fibra di vetro, e la timidina incorporata è stata misurata mediante scintillazione liquida. Tutti i dati sono stati analizzati per differenze significative da test t di Student con Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Le differenze tra doxiciclina trattata e gruppi di controllo non trattati sono stati considerati significativi se P era <0.05.

Sulla base della relazione che doxiciclina bloccato lipopolisaccaride indotta IL-1 in cellule epiteliali e impedito endotossemia letale in vivo (20, 25), abbiamo testato l’ipotesi che questo antibiotico potrebbe avere effetti diretti su SE citochine indotte. Come mostrato in Fig. 1, la dose di doxiciclina ha inibito in modo dipendente la produzione delle citochine IL-1β, IL-6, TNF-α, e IFN-γ e le chemochine MCP-1, MIP-1α, e MIP-1β da PBMC incubate con SEB. Una simile riduzione dose-dipendente delle citochine e delle chemochine da parte della doxiciclina è stata osservata anche per le PBMC stimolate con TSST-1 (dati non mostrati). L’effetto inibitorio della doxiciclina su SEB- o TSST-1-mediata citochine e chemochine ottenuti con PBMC da sette donatori normali è riassunta in Fig. 2. La produzione di MCP-1 e IFN-γ è stata completamente bloccata dalla doxiciclina 50 μM. Questa concentrazione di doxiciclina ha ridotto IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α, e MIP-1β al 15-22%, 37-41%, 21-25%, 10-15%, e 59-61% di quella delle cellule non trattate, SEB- o TSST-stimolate, rispettivamente. Il TNF-β, quando presente, è stato anche inibito al 25% di quello delle cellule non trattate e stimolate con SEB. Doxiciclina non era citotossico per PBMC a questa concentrazione come misurato dalla esclusione di trypan blu e la mancanza di lattato deidrogenasi rilascio dalle cellule trattate. L’inibizione completa di queste citochine e chemochine è stata osservata ad alte dosi di doxiciclina (>0,1 mM). Simile inibizione dose-risposta da doxiciclina è stata osservata a concentrazioni più basse di SEB (1 e 10 ng/ml) (dati non mostrati).

Perché i superantigeni causano anche la proliferazione delle cellule T, l’effetto della doxiciclina sulla proliferazione delle cellule T indotta da SE è stato studiato. La figura 3 mostra che la doxiciclina ha inibito la proliferazione delle cellule T stimolate da SEB e TSST-1 in modo dose-dipendente, raggiungendo un’inibizione del 98% a 0,05 mM.

Questo studio ha dimostrato che la doxiciclina ha inibito efficacemente la produzione mediata da superantigeni di citochine e chemochine da parte delle PBMC umane in vitro. Anche la proliferazione delle cellule T indotta dai superantigeni stafilococcici è stata completamente soppressa. La downregulation delle citochine proinfiammatorie e delle chemochine da parte della doxiciclina nelle PBMC stimolate da SEB e TSST-1 ha suggerito che la doxiciclina può influenzare la patofisiologia dello shock tossico. Questi risultati estendono le osservazioni di altri ricercatori sugli effetti immunomodulatori della doxiciclina in aggiunta alle sue attività antimicrobiche.

Molteplici meccanismi molecolari, sia trascrizionali che post-trascrizionali, possono essere coinvolti negli effetti antinfiammatori della doxiciclina (11, 26). La soppressione delle citochine proinfiammatorie può coinvolgere la downregulation della via PKC da parte della doxiciclina, come suggerito da uno studio dei suoi effetti sulla formazione del granuloma (26). La dose inibitoria riportata di doxiciclina (da 10 a 15 μM) che riduce la collagenasi, la gelatinasi e altre metalloproteinasi in vitro (10, 11) è paragonabile a quella usata in questo studio ed è molto più alta di quella osservata nel siero umano dopo una dose orale di 200 mg al giorno (10, 24). Tuttavia, gli studi clinici indicano che questa dose era sufficiente a ridurre le attività di collagenasi e gelatinasi in estratti di cartilagine umana osteoartritica ex vivo (24). Una dose subantimicrobica di doxiciclina (20 mg due volte al giorno) ha dimostrato di inibire l’attività della collagenasi nel liquido gengivale (9). Inoltre, studi in vivo di endotossemia sperimentale hanno anche trovato doxiciclina e altre tetracicline efficaci nel downregolare le citochine infiammatorie e prevenire lo shock (20).

In conclusione, i risultati qui presentati indicano che la doxiciclina down-regola le citochine proinfiammatorie e le chemochine, suggerendo così la sua potenziale utilità per il trattamento dello shock tossico indotto dal superantigene. In un contesto clinico in cui l’ospite è esposto a più agenti biologici, compresi sia i batteri che le esotossine batteriche, l’uso della doxiciclina offre un ulteriore vantaggio di fornire sia effetti antimicrobici che antinfiammatori.