Nel sistema HC-FIA, le FNP funzionalizzate con il DNA della sonda amplificano il segnale dell’ibridazione dell’RNA virale e del DNA della sonda. Il principio di progettazione del biosensore HC-FIA è mostrato in Fig. 1.
a, Il principio di HC-FIA. b, Risultati rappresentativi su una striscia a flusso laterale. c, Il dispositivo di analisi a fluorescenza. d, Una fotografia della valigia laboratorio portatile, che ha una lunghezza di 55,5 cm, una larghezza di 37 cm e un’altezza di 23 cm, con un peso di 8,5 kg. e, Il processo di analisi del test HC-FIA. Fase 1: ibridazione dell’acido nucleico in un incubatore a temperatura costante. Fase 2: determinazione dell’intensità dei segnali di fluorescenza sulla scheda di test utilizzando il dispositivo mostrato in c. f, Distribuzione della sonda nel genoma di SARS-CoV-2.
Progettazione e funzionamento del test HC-FIA
Gli anticorpi monoclonali murini S9.6 sono prefissati sulla linea del test (T) della striscia a flusso laterale, e la linea di controllo (C) è rivestita con anticorpi policlonali di capra anti-rabbit IgG (Fig. 1a). Le FNP etichettate con anticorpi S9.6 e IgG di coniglio sono poste nella provetta di reazione. All’inizio del processo di rilevamento, il SARS-CoV-2 nel tampone della gola o nel campione di espettorato viene lisato e rilasciato, e l’RNA rilasciato si ibrida con la sonda specifica del DNA SARS-CoV-2. L’ibrido RNA-DNA risultante viene catturato dagli anticorpi S9.6 marcati FNP e il complesso scorre lungo il tampone del campione e la membrana di nitrocellulosa verso la carta assorbente sotto la forza capillare. Quando passa attraverso l’area T, il complesso viene catturato dagli anticorpi S9.6, generando gradualmente un segnale fluorescente. Nell’area C, le IgG di coniglio marcate con FNP sono catturate dalle IgG anti-coniglio. La presenza o l’assenza del target SARS-CoV-2 RNA si basa su un valore di cut-off per l’intensità di fluorescenza (Fig. 1b,c). La Figura 1d mostra un laboratorio portatile a valigia che ha la capacità di fornire risultati qualitativi in meno di un’ora dopo le due fasi seguenti: ibridazione e analisi di immunofluorescenza (Fig. 1e).
Qui abbiamo usato il rapporto tra il segnale di fluorescenza del test e il segnale di fluorescenza del controllo (T/C) sulla striscia a flusso laterale in modo da minimizzare l’influenza di qualsiasi fluorescenza di fondo della carta del test. Misurando il rapporto T/C dei campioni di tampone della gola di 211 individui sani, abbiamo scoperto che il rapporto T/C di fondo medio era 49,95, con una s.d. di 17,16 (Fig. 1a supplementare). La curva caratteristica operativa del ricevitore (ROC) e l’area sotto la curva (AUC) sono state utilizzate per determinare il valore di cut-off e valutare l’accuratezza diagnostica del test HC-FIA sulla base della sensibilità e della specificità a varie soglie. Abbiamo determinato una curva ROC con un AUC di 0,999 con un intervallo di confidenza (CI) del 95% di 0,997-1,000 (Fig. 1b supplementare) utilizzando campioni di tampone della gola di 100 casi COVID-19 clinicamente confermati ed esclusi. Il valore di cut-off che ha ottenuto la maggiore sensibilità e specificità è stato determinato in 102,07, corrispondente al punto dell’indice di Youden di 0,980. In alternativa, un valore di soglia pari al doppio del valore di fondo negativo (qui, 49,95 × 2 = 99,90) è solitamente utilizzato come valore di cut-off nei test immunologici. Per comodità, abbiamo scelto un valore di cut-off T/C di 100,00.
Sviluppo del testHC-FIA
L’ottimizzazione delle sonde a DNA per la sequenza di RNA target della SARS-CoV-2 è fondamentale per migliorare l’efficienza del test. Un elenco di tutte le sequenze di sonde a DNA che abbiamo progettato è fornito nella Tabella 1 supplementare. Il genoma di SARS-CoV-2 comprende circa 30.000 basi, compreso un numero variabile (6-11) di cornici di lettura aperte (ORF). Il primo ORF rappresenta circa il 67% dell’intero genoma e codifica 16 proteine non strutturali, nonché proteine aiutanti e proteine strutturali. Le quattro principali proteine strutturali sono la glicoproteina del picco (S), la piccola proteina dell’involucro (E), la proteina della matrice (M) e la proteina del nucleocapside (N)15,16. La maggior parte dei test di rilevamento dell’acido nucleico per la SARS-CoV-2 utilizza le seguenti tre regioni conservate nel genoma virale: ORF1ab, in cui si trova il gene della polimerasi RNA-dipendente (rdrp)15, e le regioni che codificano N ed E.
Abbiamo iniziato recuperando la sequenza del genoma RNA di SARS-CoV-2 dal National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank (numeri di accesso, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 e NC_045512.1). Un’analisi dettagliata di altre sequenze pubblicate per il genoma della SARS-CoV-2 non ha rivelato alcuna variazione notevole in queste regioni. Con l’aiuto del software di progettazione Primer Premier 5.0, abbiamo progettato tre sonde per ciascuna delle tre regioni: CoV01 e CoV04, situate nella regione raccomandata per il rilevamento di ORF1ab e N, rispettivamente; e CoV08, nella stessa regione di E17. Le posizioni del genoma dei siti di legame delle sonde nella sequenza del genoma di riferimento (NC_045512.2) sono indicate nella Fig. 1f.
L’allineamento delle sequenze è stato condotto tra le sonde a DNA progettate e le sequenze del genoma umano e dei genomi di virus, batteri, micoplasma, clamidia e altri patogeni comuni. Le sonde corrispondevano solo alla sequenza genomica di SARS-CoV-2, e non abbiamo trovato alcuna omologia con il DNA genomico umano. Gli pseudovirus che portano diverse regioni del gene bersaglio costruiti usando lentivirus come vettori sono stati usati come controlli positivi. Le sequenze del gene bersaglio degli pseudovirus usati sono mostrate nella tabella 2 supplementare. P1 era positivo per la regione N del SARS-CoV-2, P2 per la regione E del SARS-CoV-2 e P3 per la regione ORF1ab del SARS-CoV-2. La concentrazione dei tre controlli positivi era di 3.000 unità di trasduzione (TU) ml-1, indicando che c’erano 3.000 particelle virali infettive per ml. La soluzione fisiologica, l’acqua purificata e i campioni di tampone faringeo positivi per altri patogeni comuni sono stati usati come controlli negativi di N1-N17. Un elenco di informazioni sui riferimenti positivi e negativi utilizzati nello studio è fornito nella tabella 3 supplementare. I risultati dei test sono riportati nelle tabelle supplementari 4-6. Per la regione ORF1ab, le sonde CoV01 e CoV03 sono stati selezionati, per la regione E, la sonda CoV08 è stato selezionato, e per la regione N, le sonde CoV04 e CoV06 preferenzialmente legato al target RNA. Le sonde a DNA selezionate sono state ulteriormente ottimizzate per combinazione (Tabella supplementare 7), con ciascun gruppo di sonde che miravano contemporaneamente a tutti e tre i segmenti. I risultati del test HC-FIA nella tabella supplementare 8 mostrano che la combinazione delle sonde Cov01, Cov04 e Cov08 (gruppo 2) ha discriminato tra tutti i campioni di controllo positivi e i controlli negativi e ha rilevato campioni positivi con un basso titolo virale (1.000 TU ml-1; tabella supplementare 3, L1-L3) con un tasso di positività superiore al 95%. Il gruppo 2 è stato quindi selezionato come combinazione finale. Ad oggi, ci sono 13.411 sequenze nucleotidiche di SARS-CoV-2 pubblicate su NCBI. L’allineamento delle tre sonde con la corrispondente regione bersaglio nelle 13.411 sequenze caricate ha rivelato che le regioni bersaglio delle sonde erano conservate abbastanza da produrre una somiglianza del 100%.
Abbiamo anche ottimizzato le condizioni del test, in particolare il tempo di incubazione per l’ibridazione e il tempo di lettura della striscia di test. La performance del test per tempi di incubazione di 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min e 60 min a 56 °C è mostrata nella tabella 9 supplementare. Si noti che 20 min era sufficiente per le sonde di DNA per ibridare con la regione bersaglio, che è stato riflesso dal tasso del 100% positivo nel rilevamento di tamponi della gola positivo e campioni di espettorato con basso titolo virale (1.000 TU ml-1; Tabella supplementare 3, L1-L3). Quando il tempo di incubazione è stato esteso a 50 o 60 minuti, la reazione non è stata altrettanto stabile, poiché il tasso di positività dei campioni di riferimento L1-L3 è diminuito. Prendendo in considerazione l’efficienza di rilevamento e il requisito per l’inattivazione del virus, abbiamo selezionato 30 min come tempo di incubazione per l’ibridazione a 56 °C. Abbiamo anche valutato il tempo di lettura della striscia per i valori 10 min, 12 min, 15 min e 18 min (Tabella supplementare 10). I risultati hanno indicato che 12 min o più a lungo hanno portato al rilevamento corretto dei campioni di riferimento positivi e negativi. Tuttavia, il coefficiente di variazione (CV) era inferiore al 10% per il rilevamento di campioni positivi con un basso titolo virale solo quando si utilizzava un tempo di lettura di 15 min. Abbiamo quindi selezionato un tempo di lettura di 15 min.
Tiocianato di guanidinio e cloruro di guanidina – i denaturanti proteici più utilizzati per l’estrazione degli acidi nucleici – sono stati confrontati come mezzi di trasporto per la conservazione dei campioni. Il guanidinio tiocianato ha portato a migliori prestazioni nella discriminazione tra campioni positivi e negativi, con un CV relativamente basso per i campioni con un basso titolo virale. Infatti, guanidinio tiocianato ad una concentrazione fino a 6 mol l-1 ha dimostrato eccellenti proprietà antivirali 18. Abbiamo selezionato il guanidinio tiocianato ad una concentrazione di 5 mol l-1 come denaturante proteico per l’inattivazione virale nel mezzo di trasporto.
Specificità del test HC-FIA
Dopo aver ottimizzato le sequenze della sonda e le condizioni di reazione, abbiamo esaminato la specificità del test HC-FIA per rilevare la SARS-CoV-2. I controlli positivi comprendevano pseudovirus (campioni P1-P3) con geni bersaglio e cinque campioni di tamponi di gola clinici (campioni P4-P8), confermati utilizzando un kit di rilevamento dell’acido nucleico basato sulla RT-qPCR (Shanghai ZJ Bio-Tech). I controlli negativi, che consistevano in campioni di tampone della gola, sono stati confermati negativi per la SARS-CoV-2, e positivi per l’influenza A, l’influenza B, il virus respiratorio sinciziale, la clamidia pneumoniae, l’adenovirus o altri patogeni (campioni N5-N17), o pseudovirus-positivi per la regione N della MERS (campione N18) o della SARS (campione N19). Un elenco di tutti i campioni è fornito nella tabella supplementare 3. Un elenco dei risultati di rilevamento di 8 campioni di riferimento positivi e 15 campioni di riferimento negativi è fornito nella Tabella supplementare 11.
Abbiamo studiato se c’era cross-reattività tra SARS-CoV-2 e 55 patogeni comuni che causano malattie respiratorie. L’origine e le informazioni quantitative di ogni microrganismo patogeno sono fornite nel Dataset 1 supplementare. Il titolo originale del virus è stato determinato in 106 unità formanti placche per ml utilizzando un test delle placche. Per i campioni di interferenza di batteri, micoplasma e clamidia, il livello di concentrazione era di 107 unità formanti colonie per ml. Inoltre, il DNA genomico umano è stato estratto e quantificato in 90-105 µg ml-1 da tre campioni di sangue intero. Il test HC-FIA ha mostrato un’eccellente specificità per la SARS-CoV-2, senza un’ovvia cross-reattività con tutti gli altri campioni di patogeni e con il DNA genomico umano (Supplementary Dataset 1).
Come l’anticorpo monoclonale S9.6 si lega anche ai duplex RNA-RNA19, specialmente quelli ricchi di AU20, abbiamo progettato sequenze di RNA a doppio filamento con frazioni variabili di AU. Informazioni dettagliate sulla sequenza è fornito nella tabella supplementare 12. Come mostrato nella tabella supplementare 13, indipendentemente dal contenuto AU, il test HC-FIA non ha mostrato un segnale positivo rilevabile verso RNA a doppio filamento, il che indica che vi è una bassa affinità di legame tra l’anticorpo S9.6 e RNA a doppio filamento nelle condizioni di saggio. Abbiamo anche studiato se la presenza di RNA a doppio filamento influisce sulle prestazioni del test nel rilevamento di campioni di tamponi della gola o di espettorato. Abbiamo utilizzato 2 campioni di tampone di gola positivi, 2 campioni di espettorato positivi, 10 campioni di tampone di gola negativi e 5 campioni di espettorato negativi. Abbiamo misurato i rapporti T/C rispetto ai valori T/C del test senza interferenze e abbiamo scoperto che i rapporti variavano tra 0,9 e 1,1 (set di dati supplementari 1). Questo indica che la presenza di RNA a doppio filamento, indipendentemente dal contenuto di AU, non influenza significativamente le prestazioni del test HC-FIA.
Sensibilità e precisione del test HC-FIA
Abbiamo diluito in serie i campioni di pseudovirus contenenti tre sezioni di geni target a titoli di 5.000, 2.500, 1.000, 800, 500, 250 e 100 TU ml-1, e calcolato i valori medi T/C per 20 test paralleli. La figura 2a mostra che i valori limite di rilevazione (LOD) degli pseudovirus positivi per le regioni N, E o ORF1ab di SARS-CoV-2 erano bassi fino a 1.000 TU ml-1, con un tasso di positività superiore al 95%. Quando i titoli dei campioni di pseudovirus hanno raggiunto 108 TU ml-1, non è stato osservato alcun effetto gancio degno di nota (Fig. 2 supplementare). L’intervallo lineare del saggio corrisponde a titoli compresi tra 103 e 106 o 107 TU ml-1.
Gli assi verticali mostrano il rapporto fluorescenza-intensità (T/C) del segnale del test (T) e il segnale di controllo (C). Per ogni concentrazione, sono stati condotti 20 test in parallelo. Il LOD è stato determinato come la concentrazione alla quale il tasso di positività era maggiore o uguale al 95%. a, rapporti T/C per campioni di pseudovirus diluiti in serie positivi per le regioni N, E e ORF1ab di SARS-CoV-2. b, rapporti T/C per campioni di tamponi della gola diluiti in serie da tre pazienti critici. I dati sono medi ± s.d.
I campioni di tampone della gola di tre pazienti gravemente malati – che sono stati determinati come positivi alla SARS-CoV-2 usando la RT-qPCR, e le cariche virali sono state quantificate usando la PCR digitale – sono stati mescolati con campioni di tampone della gola negativi per preparare diluizioni seriali di 2.000, 1.000, 500, 400 e 250 copie per ml. Come mostrato nella Fig. 2b, il LOD era di 500 copie per ml con un tasso di positività superiore al 95%. I campioni clinici di tampone della gola con valori T/C vicini al valore critico (100) per la positività (campioni con 512, 489 e 497 copie per ml della regione ORF1ab, secondo la PCR digitale) sono stati utilizzati per verificare il LOD (test eseguiti 20 volte in parallelo). Le percentuali di positività di questi campioni erano superiori al 95% (tabelle supplementari 14-16).
Per valutare la precisione del kit HC-FIA, sono stati eseguiti test in parallelo 20 volte per ogni campione clinico di tampone della gola per cinque giorni consecutivi. I campioni clinici rappresentativi scelti erano un campione positivo (1.348 copie per ml della regione ORF1ab), un campione da un individuo gravemente malato (critico; 512 copie per ml) e un campione negativo (0 copie per ml). I valori medi di T/C dei tre lotti nel rilevamento del campione positivo sono stati i seguenti: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) e 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), rispettivamente, rispetto a 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) e 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) per il campione critico, e con 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) e 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66%) per il campione negativo. I valori CV da lotto a lotto erano 3,89%, 4,66% e 6,74%. Pertanto, il test ha mostrato una buona precisione e riproducibilità per il rilevamento della SARS-CoV-2.
Robustezza del test HC-FIA
Per conoscere la robustezza dell’HC-FIA, abbiamo valutato gli effetti delle sostanze interferenti endogene (come l’emoglobina e la mucina) e delle sostanze interferenti esogene (in particolare, i farmaci clinici comunemente usati nel trattamento dei pazienti con infezioni respiratorie, compresi i farmaci antivirali, gli antibiotici e gli ormoni). Per questo esperimento, abbiamo utilizzato 18 campioni clinici di tamponi della gola, tra cui sei campioni critici (500-530 copie per ml per la regione ORF1ab, secondo la PCR digitale), sei campioni negativi e sei campioni positivi. I risultati sono stati registrati anche come rapporto dei valori T/C (campioni di interferenza rispetto ai campioni di controllo). Nei campioni di interferenza preparati, le concentrazioni di emoglobina erano 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 e 2,0 g l-1, e le concentrazioni di mucina erano 5 g l-1, 10 g l-1 e 20 g l-1. Le concentrazioni di droga dei campioni di interferenza esogena (tabelle supplementari 17-19) erano molto più alte delle loro concentrazioni plasmatiche di picco in vivo. Come previsto, tutti i rapporti T/C erano nell’intervallo di 0,9-1,1 (set di dati supplementari 2), indicando che il saggio HC-FIA è robusto alle interferenze.
Valutazione clinica del kit di test HC-FIA
Per valutare ulteriormente le prestazioni del test HC-FIA, è stato eseguito uno studio clinico randomizzato in doppio cieco confrontando il test con la RT-qPCR (kit di rilevamento SARS-CoV-2 prodotto dalla Shanghai ZJ Bio-Tech e approvato dalla NMPA) o con i risultati della diagnosi clinica in tre istituti medici indipendenti. Il kit di test HC-FIA usato nella valutazione clinica conteneva schede di test, tampone di lisi, soluzione di conservazione del campione, controlli positivi e negativi, e una provetta di reazione con sonde di DNA e anticorpi marcati. I risultati della diagnosi clinica dei casi confermati o esclusi di COVID-19, forniti dagli ospedali designati, erano basati sulle immagini della tomografia computerizzata e sulle manifestazioni cliniche dei pazienti, come specificato dalle linee guida del “Protocollo di diagnosi e trattamento della polmonite da nuovo coronavirus (versione di prova 6.0)” della Cina. Un totale di 734 campioni (593 tamponi della gola e 141 espettorato) forniti da 670 individui sono stati testati in parallelo. I dati grezzi degli studi clinici sono forniti come set di dati supplementari 3. Il kit di rilevamento RT-qPCR che abbiamo usato è stato progettato come un sistema a tre bersagli (ORF, N ed E), e abbiamo seguito il principio del test-retest per discriminare tra campioni positivi e negativi. Oltre a quattro test falliti causati da uno standard interno non valido, sono stati condotti otto retest: uno perché solo un gene target rdrp era positivo, e sette perché solo i geni N ed E erano positivi. In questi casi, i precedenti risultati negativi sono stati esclusi.
Dei 670 pazienti arruolati nello studio, 313 erano maschi (46,72%) e 357 erano femmine (53,28%). Come mostrato nella Fig. 3 supplementare, la distribuzione per età della popolazione arruolata è simile alla distribuzione per età dell’infezione da SARS-CoV-221. Anche il tasso di visita e il tasso di diagnosi erano equilibrati. I risultati dei kit di test HC-FIA sono mostrati nella Fig. 3, che mostra le fotografie dei risultati tipici sotto una fonte di luce fluorescente e la corrispondente matrice di colore a gradiente dopo la normalizzazione della lettura. La matrice di colore a gradiente nella fig. 4 mostra le letture di fluorescenza normalizzate di 734 campioni clinici (set di dati supplementari 3).
Fotografie di risultati tipici sotto una fonte di luce fluorescente, e le corrispondenti letture di fluorescenza come matrice a gradiente di colore, normalizzate al valore massimo di lettura. Il gruppo E consiste solo di risultati COVID-19-negativi. La linea orizzontale sulla barra dei colori indica il valore di cut-off. Una matrice colore-gradiente per le letture di fluorescenza di 734 campioni clinici è fornita nella Fig. 4 supplementare, e i dati numerici corrispondenti nel Dataset 3 supplementare.
Per 621 casi, i risultati HC-FIA e le diagnosi cliniche erano coerenti (210 casi confermati e 411 casi esclusi; Tabella 1); 49 casi (27 confermati e 22 esclusi dalla diagnosi clinica) non erano coerenti con i risultati HC-FIA. Per 730 campioni, i risultati del test HC-FIA erano coerenti con la RT-qPCR (249 positivi e 481 negativi; Tabella 1). Quattro campioni che erano negativi sulla base della RT-qPCR sono risultati positivi usando l’HC-FIA. Tre di questi campioni provenivano da pazienti che erano stati clinicamente diagnosticati come COVID-19-esclusi, indicando che il test HC-FIA aveva dato risultati falso-positivi. Il campione rimanente corrispondeva a un caso confermato dalla diagnosi clinica, in accordo con il test HC-FIA.
Il Kappa di Cohen (κ), che è una metrica frequentemente usata per l’affidabilità dell’accordo tra variabili categoriche, è una misura più robusta rispetto al semplice accordo percentuale tra le variabili, poiché κ tiene conto degli accordi che si verificano per caso, soprattutto in serie di dati sbilanciate. Abbiamo considerato un valore κ superiore a 0,75 per indicare un alto livello di accordo (l’accordo perfetto corrisponde a un κ = 1). Come mostrato nella tabella 2, i risultati del test HC-FIA erano in alto accordo con la diagnosi clinica (κ = 0,8393) e con RT-qPCR (κ > 0,98, indipendentemente dal tipo di campione).
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