Metodi, tecniche e protocolli di immunocitochimica

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Per assicurare il libero accesso dell’anticorpo al suo antigene, le cellule devono essere fissate e permeabilizzate. In generale, le intensità e i tempi di fissazione sono considerevolmente più brevi per le cellule che per le sezioni di tessuto più spesse e strutturalmente complesse. Per l’immunocitochimica, la preparazione del campione comporta essenzialmente il fissaggio delle cellule bersaglio al vetrino. Una fissazione perfetta immobilizzerebbe gli antigeni, mantenendo l’autentica architettura cellulare e subcellulare e permettendo l’accesso senza ostacoli degli anticorpi a tutte le cellule e ai compartimenti subcellulari. Vaste gamme di fissativi sono comunemente usati, e la scelta corretta del metodo dipenderà dalla natura dell’antigene da esaminare e dalle proprietà dell’anticorpo usato. I metodi di fissazione rientrano generalmente in due classi: solventi organici e reagenti reticolanti. I solventi organici come gli alcoli e l’acetone rimuovono i lipidi e disidratano le cellule, mentre precipitano le proteine sull’architettura cellulare. I reagenti reticolanti (come la paraformaldeide) formano ponti intermolecolari, normalmente attraverso gruppi amminici liberi, creando così una rete di antigeni collegati. I reticolanti preservano la struttura cellulare meglio dei solventi organici, ma possono ridurre l’antigenicità di alcuni componenti cellulari, e richiedono l’aggiunta di una fase di permeabilizzazione, per permettere l’accesso dell’anticorpo al campione. La fissazione con entrambi i metodi può denaturare gli antigeni proteici, e per questo motivo, gli anticorpi preparati contro le proteine denaturate possono essere più utili per la colorazione delle cellule. Sono descritti diversi metodi di fissazione. Il metodo di fissazione appropriato dovrebbe essere scelto in base all’applicazione pertinente.

1. Fissazione con acetone

  • Fissare le cellule in acetone a -20°C per 5-10 minuti.

  • Nessuno step di permeabilizzazione necessario dopo la fissazione con acetone.

2. Fissazione con metanolo

  • Fissare le cellule in metanolo a -20°C per 5-10 minuti.

  • Nessuno step di permeabilizzazione necessario dopo la fissazione con metanolo.

3. Fissazione con etanolo

  • Fissare le cellule in etanolo 95% raffreddato, 5% acido acetico glaciale per 5-10 minuti.

4. Fissazione in metanolo-acetone

  • Fissazione in metanolo raffreddato, 10 minuti a -20 °C.

  • Rimuovere il metanolo in eccesso.

  • Permeabilizzare con acetone raffreddato per 1 minuto a -20 °C.

5. Miscela metanolo-acetone Fissazione

  • Miscela 1:1 di metanolo e acetone.

  • Fare la miscela fresca e fissare le cellule a -20 C per 5-10 minuti.

6. Fissazione con miscela di metanolo ed etanolo

  • 1:1 di metanolo ed etanolo.

  • Fare la miscela fresca e fissare le cellule a -20 C per 5-10 minuti.

7. Fissazione con formalina

  • Fissare le cellule in formalina neutra tamponata al 10% per 5-10 minuti.

  • Risciacquare brevemente con PBS.

  • Permeabilizzare con 0.5% Triton X-100 per 10 minuti.

8. Fissazione con paraformaldeide e triton

  • Fissare in paraformaldeide al 3-4% per 10-20 minuti.

  • Risciacquare brevemente con PBS.

  • Permeabilizzare con 0.5% Triton X-100 per 10 minuti.

9. Fissazione con paraformaldeide-metanolo

  • Fissare in paraformaldeide al 4% per 10-20 minuti.

  • Risciacquare brevemente con PBS.

  • Permeabilizzare con metanolo raffreddato per 5-10 minuti a -20 °C.