Identificazione molecolare di specie di Mycobacterium di importanza veterinaria e per la salute pubblica da bovini dello stato meridionale del Messico

Abstract

Il genere Mycobacterium causa una varietà di malattie zoonotiche. L’esempio più noto è la tubercolosi zoonotica dovuta a M. bovis. Molto meno si sa dei “micobatteri non tubercolosi (NTM)”, che sono anche associati a infezioni nell’uomo. La norma messicana NOM-ZOO-031-1995 regola la presenza di M. bovis nel bestiame; tuttavia, non esiste alcuna norma per le specie NTM. L’obiettivo di questo studio è stato quello di isolare e identificare le specie di micobatteri non tubercolari dai bovini delle mandrie locali nella regione meridionale dello Stato del Messico attraverso l’identificazione e il rilevamento del marcatore molecolare di 100 bp nel gene 23S rRNA con successivo sequenziamento del gene 16S rRNA. Sono stati raccolti campioni di latte (35) e di essudato nasale (68). Dei 108 ceppi isolati, 39 sono stati selezionati per l’identificazione. Tredici ceppi isolati dagli essudati nasali hanno amplificato il marcatore molecolare di 100 bp e sono stati identificati come M. neoaurum (sei ceppi), M. parafortuitum (quattro ceppi), M. moriokaense (due ceppi), e M. confluentis (un ceppo). Tranne M. parafortuitum, le altre specie identificate sono di interesse per la salute pubblica e veterinaria perché sono patogene per gli esseri umani, specialmente quelli con condizioni mediche sottostanti.

1. Introduzione

Il genere Mycobacterium causa un’ampia varietà di malattie zoonotiche. L’esempio più noto è la tubercolosi zoonotica dovuta al M. bovis, di cui il bestiame è il principale serbatoio. Il M. bovis fa parte del “complesso della tubercolosi”, che comprende anche le specie M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae, e M. microti.

Nel gruppo dei micobatteri ci sono i “micobatteri non tubercolosi (NTM)”, che sono anche associati a infezioni nell’uomo. I NTM si trovano in varie fonti ambientali come il suolo, l’acqua, la vegetazione, gli animali, i prodotti lattiero-caseari e le feci e possono essere trasmessi inavvertitamente per inalazione, ingestione o penetrazione cutanea.

Lo standard messicano NOM-ZOO-031-1995 regola la presenza di M. bovis nel bestiame per controllare ed eradicare la tubercolosi bovina (bTB); tuttavia, non esiste alcun regolamento per le specie NTM. La diagnosi ufficiale della tubercolosi bovina dovuta alla presenza di M. bovis a livello del campo si basa sul test intradermico utilizzando un derivato proteico purificato (tubercolina). Anche se utilizzato per diversi anni, questo test non fornisce una buona sensibilità e specificità. Circa il 20% degli animali con tubercolosi non reagisce al test, e la presenza di altre specie micobatteriche, sia il complesso tubercolare che le specie NTM, provoca interferenze che portano a diagnosi false positive e false negative.

Anche se il Messico ha uno standard normativo, in alcune aree viene riportata una prevalenza di bTB superiore al 2%. Data la scarsa specificità e sensibilità del test alla tubercolina, è probabile che la presenza effettiva di M. bovis sia inferiore e che il tasso di infezione del bestiame da parte di altri micobatteri sia maggiore, rispettivamente. Quindi, gli allevatori di bestiame, i veterinari, i tecnici e gli impiegati che lavorano nell’industria dell’allevamento potrebbero essere esposti professionalmente alle infezioni da M. bovis e NTM. Si sa molto poco sull’esposizione professionale alle zoonosi dovute alle specie NTM perché l’identificazione di queste specie era un compito piuttosto difficile prima dello sviluppo di tecniche di identificazione basate sulla biologia molecolare.

Attualmente, le tecniche di biologia molecolare più comunemente usate per la diagnosi delle malattie causate dai micobatteri sono il polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) per la diagnosi di M. tuberculosis , la spoligotipizzazione per la diagnosi di M. bovis , e l’individuazione di una “inserzione specifica” di 100 paia di basi (bp) situata sul gene 23S rRNA caratteristico dei batteri Gram-positivi con un alto contenuto di guanina-citosina (HGC), che è considerato un marcatore molecolare per questo gruppo di batteri , seguito dall’analisi della sequenza del gene 16S rRNA per l’identificazione dei batteri a livello di specie .

Tra le specie di NTM identificate con le tecniche di cui sopra sono M. balnei, M. marinum, e M. platypoecilus, che hanno causato lesioni cutanee superficiali e profonde; M. kansasii da lesioni polmonari; M. simiae da infezioni generalizzate; M. scrofulaceum da infezioni della pelle e degli organi interni; M. szulgai associato a infezioni polmonari, osteomielite, tenosinovite e linfoadenite; M. ulcerans associato a granulomi sottocutanei; M. fortuitum e M. chelonae associati a vasculiti, endocarditi, osteomieliti, mediastiniti, meningiti, cheratiti ed epatiti; M. abscessus, associato a lesioni eritematose che progrediscono a noduli ulcerati; e altre specie.

La percentuale maggiore dell’inventario statale per i capi di bestiame nello Stato del Messico in Messico è concentrata nella regione meridionale, e una delle principali attività economiche è l’allevamento di bestiame. Il regolamento messicano per il controllo del bestiame NOM-ZOO-031-1995 si concentra solo sul test della tubercolina per la diagnosi di M. bovis. Poco si sa sulla presenza di NTM nel bestiame della regione. Data la possibilità di identificare le specie di actinobatteri tramite il rilevamento del marcatore molecolare di 100 paia di basi sul gene 23S rRNA e il successivo sequenziamento del gene 16S rRNA, è possibile identificare le suddette specie NTM.

L’obiettivo del presente studio è stato quello di isolare e identificare le specie NTM dai bovini della regione meridionale dello Stato del Messico. Le specie di Mycobacterium sono state isolate da campioni di essudato nasale e di latte bovino e identificate mediante il rilevamento del marcatore molecolare a 100 paia di basi nel gene 23S rRNA con successivo sequenziamento del gene 16S rRNA.

2. Materiali e metodi

2.1. Campionamento

Il presente studio si propone di isolare e identificare le specie di NTM dai bovini della regione meridionale dello Stato del Messico. Campionamento

È stato eseguito un campionamento basato sulla distribuzione spaziale delle mandrie positive alla tubercolosi bovina nello stato del Messico condotto da Zaragoza et al. 2015 . Sono state selezionate quattro mandrie di bovini nella regione meridionale dello Stato del Messico, una mandria appartenente al Comune di Temascaltepec e tre mandrie appartenenti al comune di Zacazonapan. Un totale di 103 campioni, 35 campioni di latte e 68 campioni di essudato nasale, sono stati raccolti. La distribuzione del numero e del tipo di campioni raccolti in ogni mandria è mostrata nella tabella 1.

2.2. Ottenere campioni di latte e di essudato nasale

Le mammelle e i capezzoli sono stati puliti con acqua purificata e sapone e poi asciugati con asciugamani di carta, e l’asepsi dei capezzoli è stata successivamente eseguita utilizzando tamponi imbevuti di alcol al 70%. Cinque millilitri di latte sono stati raccolti direttamente dal capezzolo in recipienti sterili da 20 mL, scartando il flusso iniziale. L’essudato nasale è stato raccolto direttamente dall’interno dell’orifizio nasale utilizzando un tampone sterile lungo 10 cm, che è stato poi immerso in una soluzione salina isotonica (0,85%). I campioni di latte e di essudato nasale sono stati conservati a 4°C fino all’elaborazione.

2.3. Trattamento dei campioni

2.3.1. Isolamento dei micobatteri

I campioni di latte sono stati centrifugati a 2500 giri al minuto (rpm) per 10 minuti. Il pellet dei campioni di latte e di essudato nasale è stato inoculato nel seguente terreno di coltura selettivo per micobatteri: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521), e Middlebrook (BD BBL 254521) integrato con 6 g di piruvato di sodio per litro (Middlebrook-P). I mezzi inoculati sono stati incubati a 37°C per 8 settimane e sono stati valutati ogni 3 giorni.

2.3.2. Classificazione dei ceppi isolati

I ceppi isolati sono stati distribuiti in gruppi secondo le seguenti caratteristiche: pigmentazione delle colonie, tempo di crescita e caratteristiche delle colonie (forma, consistenza, struttura e produzione di pigmenti). I ceppi isolati sono stati colorati con Ziehl-Neelsen per confermare la presenza di bacilli acido-resistenti (AFB).

2.4. Estrazione del DNA

Sono stati selezionati per l’identificazione i ceppi con caratteristiche microscopiche simili ai micobatteri (positività agli acido-resistenti) e due ceppi rappresentativi di ogni gruppo. Per ottenere la biomassa, i ceppi sono stati inoculati in 30 mL di terreno di coltura liquido Middlebrook (BD BBL 254521) in palloni da 125 mL e incubati a 37°C per 7 giorni. Il mezzo liquido è stato trasferito in tubi Falcon sterili da 15 mL e centrifugato per 15 minuti a 14.000 rpm. Poi, il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato trasferito in provette Eppendorf da 1,5 mL; le provette sono state poi centrifugate a 14.000 rpm × 5 minuti, e il surnatante è stato scartato. L’estrazione del DNA è stata eseguita sul pellet risultante utilizzando il kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega A1120).

2.5. Rilevamento del marcatore molecolare nel gene 23S rRNA

Il marcatore molecolare di 100 bp situato sul gene 23S rRNA è stato amplificato secondo la metodologia descritta da Roller et al. (1992) utilizzando i seguenti primer: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, e 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

La reazione è stata condotta utilizzando una Taq DNA polimerasi commerciale (Promega M1661). Sono state utilizzate le seguenti condizioni di ciclo termico: uno step di predenatura per 5 minuti (94°C); 29 cicli di denaturazione per 30 secondi (94°C), ibridazione per 45 secondi (46°C), ed elongazione per 50 secondi (72°C); e, infine, un ciclo di postelongazione di 5 minuti (72°C). I frammenti amplificati sono stati confermati su un gel di agarosio al 2% colorato con bromuro di etidio (SIGMA 46065).

2.6. Amplificazione del gene 16S rRNA

Le specie che hanno amplificato il marker filogenetico di 100 bp sono state selezionate per l’analisi di sequenziamento del 16S rRNA. I seguenti primer sono stati utilizzati per l’amplificazione: 8f: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG e 1492r: TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

La reazione è stata condotta utilizzando una Taq DNA polimerasi commerciale (Promega M1661). Sono state utilizzate le seguenti condizioni di ciclo termico: uno step di predenatura per 5 minuti (94°C); 34 cicli di denaturazione per 30 secondi (94°C), ibridazione per 20 secondi (52°C), ed elongazione per 1 minuto e 30 secondi (72°C); e, infine, un ciclo di postelongazione di 7 minuti (72°C).

I frammenti amplificati sono stati confermati su un gel di agarosio 1% colorato con bromuro di etidio (SIGMA 46065). I prodotti di questa amplificazione sono stati purificati utilizzando il kit Amicon Ultra Filter® (Millipore UFC901008) e confermati su un gel di agarosio all’1% per verificarne la presenza e la qualità.

2.7. Identificazione delle specie di Mycobacterium

I prodotti amplificati del gene 16S rRNA sono stati inviati al Macrogen Sequencing Service, Maryland, USA. Le sequenze ottenute sono state analizzate e corrette utilizzando il programma BioEdit . Le sequenze di consenso sono state costruite dai frammenti forward e reverse, che sono stati confrontati con le sequenze depositate in precedenza in GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizzando il programma BLAST e EzTaxon 2.1 .

2.8. Analisi filogenetica

Le sequenze del gene 16S rRNA sono state ottenute per le seguenti specie micobatteriche dalla American Type Culture Collection (ATCC) e dalla German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense e M. confluentis. Le sequenze dei ceppi della collezione e quelle dei ceppi isolati nella presente indagine sono state allineate con il programma BioEdit . L’analisi filogenetica è stata eseguita utilizzando il metodo della massima parsimonia nel software MEGA versione 4. Per formare la radice del cladogramma, è stata utilizzata la sequenza di Pantoea agglomerans DSM 3493.

3. Risultati

I 108 ceppi isolati dai 103 campioni raccolti sono stati distribuiti in 13 gruppi secondo le loro caratteristiche morfologiche macroscopiche e microscopiche (Tabella 2). I gruppi 11 e 12, in particolare, erano composti da ceppi acido-resistenti.

Gruppo Numero di ceppi Caratteristiche morfologiche Molecolare (bp) Macroscopico Microscopico 23S rRNA Pigmentazione Apparenza Ziehl-Neelsen 1 29 Giallo Crema – 250 2 10 Bianco Crema – 250 3 14 Bianco Secco – 250 4 2 Salmone Cremoso – 250 5 2 Salmone Secco – 250 6 2 Bianco, scuro Crema – 250 7 2 Bianco Crema – 250 8 3 Bianco, scuro Secco – 250 9 4 Bianco Secco – 250 10 10 Bianco Crema, secco – 250 11 10 bianco Secco + 350 e 250 12 7 Giallo Crema + 350 13 13 Bianco Secco – 250

-: assenza di bacilli acido-resistenti; +: presenza di bacilli acido-resistenti; Bp: coppie di basi.

Tabella 2

I ceppi isolati sono raggruppati secondo le loro caratteristiche morfologiche e la presenza del marcatore molecolare (100 bp) sul gene 23S rRNA. Due ceppi da ciascuno dei restanti 11 gruppi sono stati selezionati per completare i 39 ceppi. Il marcatore molecolare di 100 bp è stato trovato nel 33% (13/39) dei ceppi selezionati. Per loro, il gene 16S rRNA è stato amplificato per il sequenziamento e l’identificazione a livello di specie.

La prevalenza globale di NTM sui campioni raccolti era del 12,6% (13/103) considerando sia i campioni di latte che di essudato nasale. Tuttavia, la prevalenza specifica per i campioni di essudato nasale era del 19,1% (13/68).

Secondo il confronto delle sequenze, sono state identificate quattro specie di NTM del genere Mycobacterium; il 64% (6/13) dei ceppi aveva il 98% e il 99% di similarità con M. neoaurum, mentre il 31% (4/13) aveva il 99% di somiglianza con M. parafortuitum, il 15% (2/13) aveva somiglianze del 98% e 99% con M. moriokaense e, infine, l’8% (1/13) aveva il 99% di somiglianza con M. confluentis (Tabella 3).

Strain Origine dell’allevamento Mezzo di coltura Amplificato dimensione del frammento (bp) Similarità (Blast) % Similarità (EzTaxon) % 1-AZ 2 Middlebrook 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.3 2-AZ 2 Stonebrink 1408 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.1 3-AZ 2 Stonebrink 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.2 5-AZ 3 Stonebrink 1416 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.2 8-AZ 4 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.0 12-AZ 2 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.4 4-AZ 4 Middlebrook-P 1420 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2 9-AZ 3 Middlebrook 1415 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.9 10-AZ 4 Stonebrink 1411 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.4 11-AZ 3 Stonebrink 1414 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2 6-AZ 2 Stonebrink 1455 M. moriokaense 99 M. moriokaense 98.2 13-AZ 4 Stonebrink 1417 M. moriokaense 98 M. moriokaense 98.2 7-AZ 2 Middlebrook-P 1420 M. confluentis 99 M. confluentis 99.1

2: Zacazonapan Holstein-F; 3: Zacazonapan Holstein-F; 4: Zacazonapan Holstein-F.

Tabella 3

Confronto delle sequenze del gene 16S rRNA di ceppi isolati da bovini con quelle documentate in GenBank, usando BLAST e EzTaxon.

L’albero filogenetico è stato formato con il genere Mycobacterium e quattro delle sue specie con cui sono state osservate le relazioni filogenetiche tra i ceppi della collezione e i ceppi isolati nella presente indagine (Figura 1).

Figura 1

Albero filogenetico costruito confrontando le sequenze del gene 16S rRNA dei ceppi isolati e di riferimento.

4. Discussione

Le specie NTM sono state isolate solo da campioni di essudato nasale, eliminando così i campioni provenienti da una delle aziende locali di questo studio (Tabella 1). Abbiamo scoperto che la prevalenza specifica era del 19,1% negli allevamenti della regione meridionale dello Stato del Messico. Studi simili negli Stati Uniti, in Sudafrica, in Tanzania e in Brasile hanno riportato valori di prevalenza di NTM del 3,4%, 24,5%, 7% e 7,8%, rispettivamente; pertanto, il valore di prevalenza trovato in questo studio rientra nell’intervallo riportato in precedenza. In questo studio, 13 dei 39 ceppi analizzati sono stati identificati come le specie NTM M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis e M. parafortuitum.

M. neoaurum, un membro del complesso Mycobacterium parafortuitum, è responsabile di un ampio spettro di malattie, la maggior parte delle quali infezioni legate a dispositivi come cateteri Hickman, cateteri BROVIAC, linee PICC, fistola arterovenosa che includeva un innesto in politetrafluoroetilene, pace maker, ed endocardite della valvola prostetica. I pazienti immunocompromessi che detengono questi dispositivi sono i principali ospiti, per esempio, i pazienti affetti da cancro e i diabetici con insufficienza renale e problemi cardiaci. M. neoaurum è stato isolato anche da pazienti con infezioni urinarie, meningoencefaliti e alterazioni del sistema nervoso centrale, batteriemie ed endocarditi e infezioni polmonari. Anche se è stato isolato principalmente da casi clinici, ci sono anche rapporti sul suo isolamento dal latte e dal bestiame.

M. moriokaense è stato isolato da un campione di espettorato. Sebbene sia considerato non patogeno per l’uomo, è stato associato a malattie polmonari. Anche M. confluentis è stato isolato da campioni di espettorato e, insieme a M. parafortuitum, entrambi sono considerati specie non patogene. M. confluentis, M. moriokaense, e M. neoaurum sono stati isolati da diversi tessuti bovini e selvatici con lesioni tubercolari, mentre M. parafortuitum è stato isolato solo dal latte bovino. Tuttavia, nel nostro lavoro, M. parafortuitum è stato isolato solo da campioni di essudato nasale.

I requisiti nutrizionali dei micobatteri differiscono tra le varie specie, che è stata la ragione per l’utilizzo di diversi terreni di coltura. In particolare, sette dei 13 ceppi identificati in questo studio sono stati isolati in terreno Stonebrink, tra cui M. neoaurum, M. parafortuitum, e M. moriokaense. Questo risultato è coerente con quello descritto da Sepúlveda et al. che hanno indicato che il terreno Stonebrink è adatto al recupero di diverse specie del genere Mycobacterium. García-Martos e García-Agudo hanno riferito che il terreno Middlebrook è ottimale per l’isolamento di attinomiceti, il che è in accordo con la presente indagine, considerando che due specie, M. neoaurum e M. parafortuitum, sono state isolate in questo terreno. In particolare, M. confluentis è stato isolato solo in mezzo Middlebrook integrato con piruvato di sodio; quindi, la strategia di utilizzare diversi mezzi di coltura è stata appropriata perché ha permesso l’isolamento di diverse specie del genere Mycobacterium.

Il rilevamento del marcatore molecolare presente nel gene 23S rRNA dei batteri Gram-positivi con contenuto HGC ha permesso la discriminazione tra ceppi di eubatteri e micobatteri. L’analisi di sequenziamento del gene 16S rRNA ha reso possibile l’identificazione a livello di specie; pertanto, la combinazione di queste metodologie è appropriata per l’identificazione delle specie NTM.

5. Conclusioni

Utilizzando la metodologia descritta in questo studio, sono state isolate e identificate quattro specie di NTM: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum, e M. parafortuitum. Queste specie sono state isolate per la prima volta da essudati nasali di bovini della regione meridionale dello Stato del Messico. Tre delle specie identificate (M. neoaurum, M. moriokaense, e M. confluentis) sono di importanza per la salute pubblica e veterinaria.

Discorso

Questo lavoro è derivato dalla tesi per il titolo di dottore in Scienze della Salute (Universidad Autónoma del Estado de México), registrata nel PNPC-CONACYT.

Conflitti di interesse

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano riconoscere l’assistenza finanziaria della Segreteria di Ricerca e Studi Avanzati della Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) attraverso le seguenti borse di ricerca: (i) “Implementazione di Sistemi Informativi Geografici e Tecniche di Biologia Molecolare, come strumenti nel rilevamento e identificazione di Mycobacterium spp.”, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, e (ii) la rete “Microbiología y química en las Ciencias de la Salud”, 039/2014RIF.