Gli alleli mutanti Trp53 null e R270H hanno effetti comparabili nella regolazione dell’invasione, delle metastasi e dell’espressione genica nella tumorigenesi del colon di topo

Missense e null Trp53 promuovono la progressione del tumore del colon di topo in CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK) topi

Per sviluppare un modello murino di tumore al colon istigato da difetti genici come quelli spesso presenti nei tumori al colon umani, abbiamo generato topi mutanti composti che portano un allele Apc floxed (Apcflox, 580S, abbreviato come A) che potrebbe essere inattivato dalla funzione della ricombinasi Cre e un allele floxed, latentemente oncogeno di Kras (KrasLSL-G12D, abbreviato come K) che potrebbe essere attivato dalla ricombinazione Cre. Utilizzando il transgene CDX2P-CreERT2 e il trattamento TAM per attivare la funzione Cre nelle cellule epiteliali del colon, abbiamo preso di mira gli alleli Apc e Kras nell’epitelio dell’ileo distale, del cieco e del colon. Mentre i topi CDX2P-CreERT2 K mostrano un epitelio del colon seghettato e iperplasico, i topi CDX2P-CreERT2AK (AK) avevano un epitelio del colon seghettato e iperplastico e hanno anche sviluppato una media di 13 adenomi di dimensioni variabili da 0,5 mm a 2 mm nel momento in cui sono stati raggiunti i punti finali umani per i topi a 10-15 mesi dopo il trattamento TAM (Fig. 1a). In sei dei 10 topi AK, abbiamo trovato uno o due adenocarcinomi derivanti dal cieco. Degli otto adenocarcinomi totali trovati nei 10 topi AK studiati, sette tumori hanno invaso la muscularis propria (MP) o più in profondità e cinque hanno raggiunto la sub-serosa o serosa (Fig. 1b, Tabella 1 e Tabella 1 supplementare). Tuttavia, poiché solo 8 dei 131 tumori osservati nei topi AK erano invasivi, i risultati implicano che ulteriori difetti somatici oltre alle mutazioni Apc e Kras erano necessari per lo sviluppo di tumori invasivi del colon nei topi AK.

Mutazioni missense e nulle di Trp53 promuovono la progressione del tumore al colon nei topi CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK). a Kaplan-Meier curve di sopravvivenza di CDX2P-CreERT2AK (AK) topi (n = 10, sopravvivenza mediana = 336 giorni), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) topi (n = 16, sopravvivenza mediana = 166 giorni), topi CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) (n = 16, sopravvivenza mediana = 97 giorni) e topi CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) (n = 20, sopravvivenza mediana = 88 giorni). Il TAM è stato somministrato quotidianamente per due giorni e il tempo zero rappresenta il secondo di questi giorni. I valori di P sono stati ottenuti con il test log-rank nei seguenti confronti: P = 1.4E-6 per AK vs. AKP270/+; P = 1.4E-7 per AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1.9E-8 per AKP270/fl vs. AKP270/+. b Percentuale di tumori al colon con diverse profondità di invasione dai topi AK, AKP270/+, AKPfl/fl e AKP270/fl. I dati sono da lesioni multiple per topo (n = 10-14 topi per gruppo). P-valori basati su test Fisher Exact e test Exact Poisson sono mostrati nella Tabella 1 e Tabella 1 supplementare, rispettivamente. Le barre di errore sono l’errore standard della media. A adenoma, SM sottomucosa, MP muscularis propria, SS subserosa, S sierosa. c, d Ematossilina ed eosina (H&E) colorazione di tumori invasivi rappresentativi dal colon prossimale (destra) e cieco (sinistra) tessuti sono mostrati per AKP270/fl topi (c) e AKPfl/fl topi (d). I tumori in (c) e (d) sono stati raccolti 3 mesi dopo l’iniezione di TAM. Le immagini ad alto ingrandimento sono mostrate nei pannelli in basso e sono racchiuse nelle aree a basso ingrandimento nei corrispondenti pannelli in alto. Le linee tratteggiate indicano il confine tra strato muscolare e subserosa. Barre di scala: 500 μm per l’immagine a basso ingrandimento (pannelli superiori); 100 μm per immagini ad alto ingrandimento (pannelli in basso)

Come notato sopra, le mutazioni TP53 si trovano in circa il 60% dei CRC umani e sembrano essere selezionati per durante la progressione adenoma-carcinoma. Abbiamo cercato di valutare la cooperazione dell’inattivazione di Trp53 con le mutazioni Apc e Kras nella progressione del tumore del colon in vivo, così come di determinare se i potenziali effetti GOF di un allele mutante missenso Trp53 potrebbero essere visti nel modello. Abbiamo introdotto un allele mutante costitutivo Trp53R270H (l’equivalente murino dell’umano R273H, indicato come P270) e/o un allele condizionale nullo Trp53flox (indicato come Pfl) nel modello AK. Sono stati generati topi con genotipi composti e le loro abbreviazioni sono le seguenti: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (topi AKP270/+), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (topi AKP270/fl) e CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (topi AKPfl/fl). Coorti di topi adulti AKP270/+, AKP270/fl e AKPfl/fl sono state indotte per i tumori del colon tramite il trattamento TAM e il loro stato di salute è stato monitorato. Rispetto ai topi AK (sopravvivenza mediana = 336 giorni), i topi AKP270/+, AKP270/fl, AKPfl/fl avevano tutti una durata di vita significativamente ridotta. I topi AKP270/fl e AKPfl/fl avevano sopravvivenze mediane di 88 e 97 giorni, rispettivamente, e i topi AKP270/+ avevano una sopravvivenza mediana di 166 giorni (Fig. 1a). I topi AKP270/+ avevano una sopravvivenza significativamente più lunga rispetto ai topi AKP270/fl e AKPfl/fl (P < 0.0001 per ciascuno rispetto ai topi AKP270/+), ma nessuna differenza di sopravvivenza statisticamente significativa è stata vista quando si confrontano i topi AKP270/fl e AKPfl/fl (Fig. 1a). L’aggiunta della mutazione Trp53 (R270H o null) ha aumentato significativamente l’incidenza complessiva del tumore rispetto a quello visto nei topi AK (P < 0.0001 per entrambi AKPfl/fl e AKP270/fl, rispetto ai topi AK, Tabella supplementare 1 in basso a sinistra). AKP topi avevano anche più tumori del colon e del cieco che manifestavano caratteristiche invasive (7.3 e 8.9 tumori invasivi per topo per AKPfl/fl topi e AKP270/fl topi, rispettivamente) rispetto ai topi AK (0.8 tumori invasivi per topo; Fig. 1b e Tabella supplementare 1 in alto a destra, P < 0.0001 per entrambi AKPfl/fl contro. AK e AKP270/fl vs. AK confronti).

L’analisi approfondita dei tessuti del cieco e del colon dei topi ottenuti alla necroscopia ha definito l’ampio carico tumorale nei topi AKP270/+, AKPfl/fl e AKP270/fl, con lesioni che vanno dagli adenomi agli adenocarcinomi in fase avanzata (Fig. 1b-d e Tabella 1). Tutti i topi AKP270/+, AKPfl/fl e AKP270/fl studiati portavano almeno un adenocarcinoma (tumori con invasione sottomucosa o più profonda). Prove di invasione nella muscolatura liscia e, in alcuni casi, alla sierosa sono state trovate sia nel cieco che nelle regioni prossimali del colon dei topi AKP270/fl e AKPfl/fl (Fig. 1c, d, rispettivamente). I topi AKP270/+, dove le cellule epiteliali bersagliate da Cre mantengono inizialmente un allele Trp53 wild-type funzionale, hanno avuto un periodo di latenza più lungo per lo sviluppo del tumore e il carico tumorale complessivo (18,5 per topo) e le percentuali di tumori con invasione più profonda (11.9%) erano significativamente inferiori rispetto ai topi AKP270/fl o AKPfl/fl (Tabella 1 e Tabella 1 supplementari, P < 0.01 rispetto ai topi AKP270/fl o AKPfl/fl per il carico tumorale per topo e le percentuali di adenocarcinomi). Questi risultati supportano la nozione di p53 wild-type ha una funzione di soppressore tumorale nella tumorigenesi del colon anche nel contesto di un allele mutante missenso Trp53. Quando tutti i tumori osservati sono stati confrontati tra AKP270/fl e AKPfl/fl topi, abbiamo trovato la proporzione di adenocarcinomi con sottomucosa o invasione più profonda era più alto in AKP270/fl topi che in AKPfl/fl topi (36.9% e 26.1% per AKP270/fl e AKPfl/fl topi, rispettivamente; Tabella 1, P = 0.0026), suggerendo un possibile modesto effetto GOF per l’allele R270H Trp53 nel migliorare l’invasione del tessuto. Tuttavia, il modesto aumento del potenziale invasivo nei topi AKP270/fl può essere compensato, perché il carico tumorale medio per topo tendeva più alto nei topi AKPfl/fl rispetto ai topi AKP270/fl (28.0 vs 24.2 per topo, P = 0.054; Tabella supplementare 1), e i topi AKPfl/fl e AKP270/fl non hanno mostrato differenze significative nell’incidenza di adenocarcinomi (7.3 vs 8.9 adenocarcinomi per topo, Tabella supplementare 1 in alto a destra, P = 0.16). Inoltre, l’invasione di alcuni tumori in muscularis propria, subserosa, o serosa è stato visto in entrambi i AKP270/fl e AKPfl/fl topi (Fig. 1b e Tabella 1). Poiché solo circa il 30% dei tumori dai topi AKP270/fl o AKPfl/fl è progredito in adenocarcinomi durante il periodo di studio, ulteriori alterazioni somatiche oltre ai difetti di Apc, Kras e Trp53 sono probabilmente critici nel generare carcinomi nei topi AKP.

Istologia del tumore e metastasi nei topi AKP270/fl o AKPfl/fl

Ognuno dei topi AKP270/fl e AKPfl/fl ha sviluppato uno o più adenocarcinomi al momento del raggiungimento degli endpoint umani. Nei topi AKP270/fl, più dell’80% degli adenocarcinomi ha mostrato caratteristiche da ben differenziate a moderatamente differenziate, con gemmazione/sporgenza tumorale al fronte di invasione e occasionale secrezione di mucina (Fig. 2a, in alto). Circa il 15-20% degli adenocarcinomi AKP270/fl erano scarsamente differenziati, con morfologia solida di tipo trabecolare (Fig. 2a, al centro). Rari carcinomi a cellule ad anello sono stati visti nei topi AKP270/fl (Fig. 2a, in basso). Nei topi AKPfl/fl, circa il 50% degli adenocarcinomi erano ben differenziati o moderatamente differenziati con secrezione di mucina (Fig. 2b, in alto); i rimanenti erano scarsamente differenziati (Fig. 2b, in basso). Una forte colorazione nucleare e citoplasmatica di β-catenina è stata vista nei tumori invasivi AKP270/fl e AKPfl/fl (Fig. 2, in mezzo), coerente con una segnalazione Wnt difettosa derivante dall’inattivazione di Apc. Una forte colorazione nucleare per p53 è stata osservata nelle cellule tumorali AKP270/fl. Come previsto, nessuna colorazione di p53 è stata vista nelle cellule tumorali AKPfl/fl (Fig. 2, destra).

I tipi istologici di adenocarcinomi del colon da topi mutanti p53. Le macchie H&E (pannelli di sinistra) e le macchie immunoistochimiche per β-catenina (pannelli centrali) e p53 (pannelli di destra) sono mostrate per tumori del colon indipendenti di tipi istologici rappresentativi dai topi AKP270/fl (a) e AKPfl/fl (b). I tumori sono stati raccolti 3 mesi dopo l’induzione di TAM. Barre della scala: 50 μm

Alla necroscopia, metastasi linfonodali sono state trovate in 3 dei 13 topi AKPfl/fl e 5 dei 14 topi AKP270/fl (tabella 2). Tra i tre topi AKPfl/fl che avevano ciascuno una metastasi in un linfonodo addominale, un topo aveva anche metastasi multiple al polmone e un altro topo aveva metastasi multiple al fegato (Tabella 2). Tra i cinque topi AKP270/fl con metastasi in un linfonodo addominale, un topo aveva metastasi multiple al polmone e un altro aveva lesioni metastatiche sia nel polmone che nel fegato (Tabella 2). Nessuna lesione metastatica è stata trovata nei topi AK o AKP270/+ (Tabella 2). I nostri dati indicano che i topi CRC con mutazioni missense o nulle in Trp53 possono dare origine a linfonodi spontanei e metastasi a distanza con frequenze comparabili, sostenendo contro un effetto GOF per le mutazioni missense Trp53 nel migliorare le metastasi nel nostro modello di CRC del topo.

Transizione epiteliale-mesenchimale nei CRC metastatici con Trp53 missense o nullo

Nei singoli depositi metastatici linfonodali trovati in ciascuno dei cinque diversi topi AKP270/fl, quattro lesioni hanno mostrato un adenocarcinoma moderatamente differenziato e una lesione era scarsamente differenziata (Fig. 3a, b, pannelli superiori). Tutte le lesioni metastatiche linfonodali moderatamente differenziate avevano una forte colorazione nucleare di β-catenina così come una forte colorazione di membrana per E-caderina e una colorazione di vimentina assente (Fig. 3a), suggerendo la conservazione delle proprietà epiteliali nelle cellule metastatiche AKP270/fl che hanno mantenuto caratteristiche moderatamente differenziate. Nel topo AKP270/fl in cui le metastasi linfonodali avevano caratteristiche scarsamente differenziate, lesioni adenocarcinoma con morfologia scarsamente differenziata sono state trovate anche nel polmone, fegato e cieco (Fig. 3b e Fig. 1 supplementare). La lesione del cieco scarsamente differenziata e le lesioni metastatiche hanno mostrato una forte colorazione nucleare di β-catenina e la perdita di espressione di E-caderina e una forte espressione di vimentina, coerente con le caratteristiche di transizione epitelio-mesenchimale (EMT) (Fig. 3b e Fig. 1 supplementare). Tutte le lesioni metastatiche nei topi AKP270/fl si sono colorate positivamente per CDX2 (Fig. 2 supplementare), coerentemente con la loro origine epiteliale del colon.

I tumori metastatici derivati dal colon con mutazioni missenso Trp53 possono subire una transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Fotomicrografie di sezioni colorate con H&E che mostrano le metastasi linfonodali e polmonari trovate in due topi rappresentativi AKP270/fl (a, b, pannelli superiori). Macchie immunoistochimiche che mostrano una forte espressione nucleare di β-catenina, una forte espressione di membrana di E-caderina e l’assenza di espressione di vimentina per le lesioni moderatamente differenziate trovate in un topo rappresentativo (a, tre pannelli inferiori). Al contrario, le lesioni scarsamente differenziate trovate in un altro topo (b) mostrano una forte espressione nucleare di β-catenina, perdita di espressione di E-caderina e forte espressione di vimentina, indicando che le lesioni metastatiche trovate in questo topo hanno subito EMT (b, tre pannelli inferiori). Le fotomicrografie rappresentative delle sezioni colorate con H&E sono state mostrate con ingrandimento a bassa potenza per l’orientamento; le sezioni seriali sono state sottoposte a colorazione immunoistochimica e l’area incasellata con macchie per β-catenina, E-caderina e vimentina sono state mostrate come ingrandimento ad alta potenza. Barre della scala: 20 μm per tutte le immagini

Due delle tre metastasi linfonodali da topi portatori di tumore AKPfl/fl erano moderatamente differenziate e una era scarsamente differenziata (Fig. 4a, b, pannelli superiori). Il topo AKPfl/fl con metastasi al fegato aveva una metastasi linfonodale moderatamente differenziata. In questo topo con metastasi al fegato, l’adenocarcinoma primario del colon indice presuntivo così come le lesioni linfonodali e metastatiche al fegato hanno tutte mostrato una forte espressione nucleare di β-catenina e una forte espressione di membrana di E-caderina (Fig. 3 supplementare). Nel singolo topo AKPfl/fl con una metastasi linfonodale scarsamente differenziata, lesioni multiple con morfologia simile sono state trovate anche nel suo polmone (Fig. 4b). Gli studi immunoistochimici hanno mostrato che le lesioni metastatiche polmonari e l’adenocarcinoma primario indice presuntivo nell’intestino cieco avevano tutti una forte espressione nucleare di β-catenina e una ridotta espressione di E-caderina e una forte espressione di vimentina, coerente con EMT nel cancro primario e nelle cellule metastatiche (Fig. 4b). Le lesioni metastatiche nei topi AKPfl/fl erano tutte CDX2-positive (Fig. 4 supplementare). Nel complesso, i nostri dati indicano che non vi è alcuna differenza significativa nelle caratteristiche istologiche delle lesioni metastatiche derivanti da topi AKP270/fl o AKPfl/fl, e il sottogruppo scarsamente differenziato dei tumori primari e le lesioni metastatiche con mutazioni missenso o nulle di Trp53 possono manifestare caratteristiche EMT.

I tumori metastatici derivati dal colon con mutazioni Trp53 nulle possono subire la transizione epitelio-mesenchimale (EMT). a Fotomicrografia di una sezione colorata con H&E che mostra una lesione tumorale moderatamente differenziata trovata nel linfonodo di un topo AKPfl/fl rappresentativo 2,5 mesi dopo l’iniezione di TAM (pannello superiore). Le macchie immunoistochimiche per questa lesione mostrano una forte espressione nucleare di β-catenina, una forte espressione di membrana di E-caderina e l’assenza di espressione di vimentina (tre pannelli in basso). b Fotomicrografie di sezioni colorate con H&E che mostrano le lesioni scarsamente differenziate trovate nel cieco, nel linfonodo e nel polmone di un altro topo AKPfl/fl 4 mesi dopo l’iniezione di TAM (pannello superiore). Tutte queste lesioni mostrano una forte espressione nucleare di β-catenina, perdita di espressione di E-caderina e forte espressione di vimentina, indicando che le lesioni primarie e metastatiche trovate in questo topo hanno subito EMT (pannelli inferiori tre). Le fotomicrografie rappresentative delle sezioni colorate con H&E sono state mostrate con ingrandimento a bassa potenza per l’orientamento; le sezioni seriali sono state sottoposte a colorazione immunoistochimica e l’area incorniciata con macchie per β-catenina, E-caderina e vimentina sono state mostrate con ingrandimento ad alta potenza. Barre di scala: 20 μm per tutte le immagini

La stabilizzazione della proteina p53 mutante missenso è associata alla perdita di p53 wild-type e alla progressione della malattia

La maggior parte dei tumori umani con mutazioni TP53 missenso sono stati riportati per mostrare la perdita di eterozigosi (LOH) di TP53, e uno studio ha indicato che la LOH di TP53 è un prerequisito per la stabilizzazione di p53 mutante missenso sia nei sarcomi del topo che nei carcinomi del seno. Abbiamo valutato i modelli di colorazione di p53 in varie fasi dello sviluppo del tumore nei topi AKP270/+ dopo l’induzione della tumorigenesi con l’iniezione di TAM, perché l’epitelio del colon mirato a Cre nei topi AKP270/+ ha inizialmente un allele Trp53 funzionale. Nei polipi iperplastici nei topi AKP270/+, dove Kras è attivato e Apc LOH non si era ancora verificato, colorazione p53 non è rilevabile (Fig. 5b, pannello HP), simile alla colorazione negativa per p53 visto nell’epitelio di topi wild-type (Fig. 5a), anche se la proteina mutante missenso R270H p53 è costituzionalmente espresso nei tessuti del colon dei topi AKP270/+. Una certa immunoreattività della p53 è stata chiaramente vista negli adenomi (Fig. 5b, pannello adenoma e Tabella 3, n = 185) e nei carcinomi (Fig. 5c e Tabella 3, n = 28) che insorgono nei topi AKP270/+. Tra questi tumori, il 94% degli adenomi e il 43% dei carcinomi ha mostrato una debole colorazione di p53 (Fig. 5 e Tabella 3, 5-10% di positività), mentre il 6% degli adenomi e il 57% dei carcinomi aveva una forte colorazione di p53 (Fig. 5 e Tabella 3, >10% di positività, P < 0.0001). La maggior parte dei tumori con forte colorazione di p53 ha mostrato LOH di p53, mentre i tumori con debole colorazione di p53 conservavano ancora l’allele Trp53 wild-type (Fig. 6). I nostri risultati sono simili a quelli visti in un recente lavoro sull’espressione della proteina missenso p53 nei sarcomi del topo e nel carcinoma mammario. I nostri dati dimostrano che, analogamente alla situazione nella tumorigenesi del colon umano, l’espressione di una proteina p53 mutante missenso stabilizzata è strettamente correlata alla perdita della funzione p53 wild-type e alla progressione verso l’invasione.

La stabilizzazione della proteina mutante p53R270H durante la progressione tumorale da iperplasia a carcinoma nei topi AKP270/+. Colorazione immunoistochimica di p53 in un polipo iperplastico rappresentativo (HP, b, pannello sinistro), un adenoma (b, pannello destro) e tre carcinomi (c) derivanti dall’intestino cieco di topi AKP270/+. Una sezione dal cieco di un topo wild-type è stata usata come controllo (a). La colorazione di p53 varia da una colorazione non rilevabile nelle sezioni normali (a) e HP (b), a una colorazione debole (<10% di positività) nell’adenoma (b) e nel carcinoma 1 (c, pannello sinistro), e a una forte colorazione nei carcinomi 2 e 3 (>10% di positività). Le linee tratteggiate indicano la muscularis mucosae. Le frecce nere indicano le ghiandole invasive con debole colorazione di p53; le frecce rosse indicano le ghiandole invasive con forte colorazione di p53. Barre di scala: 50 μm

La stabilizzazione del mutante missenso p53R270H è correlata alla perdita di eterozigosi (LOH) di p53. a Genotipizzazione dei tumori del colon (T2-T6) che sorgono in topi AKP270/+ 5 mesi dopo l’induzione del TAM. Un tumore derivante da un topo AKP270/fl (T1) e il tessuto del colon da un topo wild-type (N) sono usati come controllo positivo e negativo, rispettivamente. La presenza dell’allele Trp53 wild-type e l’allele mutante ricombinato Trp53 (flox out) sono stati rilevati tramite PCR. b-e La colorazione immunoistochimica di p53 nei tessuti del colon descritti in (a) mostrano una forte correlazione tra la stabilizzazione di p53 mutante (d, T2 e T3) e la perdita di eterozigosi di p53, rispetto alla debole colorazione di p53 e la presenza dell’allele Trp53 wild-type nei tumori 4-6 (e). Le linee tratteggiate indicano la muscularis mucosae. Barre di scala: 100 μm

Il profilo dell’espressione genica globale rivela poche differenze tra le cellule tumorali del colon nel topo o nell’uomo che ospitano il mutante missenso R270H/R273H e gli alleli Trp53/TP53 nulli

Abbiamo profilato l’espressione genica nei tessuti di adenocarcinoma del colon dai topi AKP270/fl (n = 6) o AKPfl/fl (n = 6), usando Affymetrix Mouse ST 2.1 Arrays con 24.562 set di sonde. Abbiamo isolato l’RNA dopo la microdissezione a cattura laser (LCM) delle cellule tumorali da un tumore primario invasivo di ogni topo. Come controlli, sono state incluse cellule epiteliali del colon normali microdissezionate da topi wild-type (n = 3). Abbiamo adattato modelli ANOVA a questi 15 campioni con termini per 3 mezzi. Il confronto dei tessuti tumorali con i tessuti normali ha dato oltre 2400 set di sonde con P < 0.001 per entrambi i tumori AKP270/fl e AKPfl/fl, ma il confronto dei due tipi di tumore tra loro ha dato solo 30 set di sonde, dove ci aspettiamo 24,6 set di sonde (24,562*0.001) semplicemente per caso. Quest’ultimo risultato indica che la maggior parte dei 30 set di sonde trovati sono falsi positivi (Tabella 4, porzione superiore), e c’erano poche se qualsiasi differenze significative osservabili nell’espressione genica tra i tumori del colon con mutazioni missenso Trp53 e quelli con mutazioni nulle Trp53. Coerentemente con questa nozione, abbiamo trovato gli adenocarcinomi AKP270/fl e AKPfl/fl indistinguibili nelle analisi delle componenti principali (PC) dell’espressione genica, anche se entrambi i gruppi di tumori hanno modelli di espressione genica che sono chiaramente distinti dall’epitelio del colon wild-type (Fig. 5).

Abbiamo anche condotto analisi di espressione genica Affymetrix su organoidi derivati da tumori del colon derivanti da topi AKP270/fl (n = 3) o AKPfl/fl (n = 2). Gli organoidi derivati da adenomi in topi Apcfl/fl (Cont 1, n = 3) o da epitelio del colon wild-type (Cont 2, n = 4) sono stati usati come controlli. Abbiamo adattato un modello ANOVA ai quattro gruppi di organoidi. Abbiamo trovato 435 set di sonde con P < 0,001 per gli organoidi AKPfl/fl e 609 set di sonde per gli organoidi AKP270/fl, rispetto agli organoidi Apc-null (Cont 1, Tabella 4). Inoltre, sono stati identificati più set di sonde differenzialmente espressi (960 per AKPfl/fl e 1332 per AKP270/fl, P < 0.001) quando gli organoidi AKPfl/fl o AKP270/fl sono stati confrontati agli organoidi del colon normale (Cont2, Tabella 4). Abbiamo eseguito il test di arricchimento del percorso sui geni che erano differenzialmente espressi sia nei tumori AKPfl/fl e AKP270/fl e organoidi rispetto al normale epitelio del colon. Abbiamo trovato che una varietà di percorsi sono stati significativamente alterati in entrambe le cellule derivate dal tumore p53 null e missenso mutante, con geni coinvolti in G2M-checkpoint, crescita cellulare, risposta allo stress e metabolismo cellulare come i set di geni più significativamente cambiato (Tabella supplementare 2). Tuttavia, abbiamo ottenuto solo 35 set di sonde con P < 0,001 per AKPfl/fl vs AKP270/fl confronto (Tabella 4), dove ancora una volta 24.6 erano attesi dal caso, dimostrando che era difficile trovare differenze di espressione genica tra gli organoidi con null e missense Trp53 mutazioni. I grafici PC hanno mostrato che i campioni AKPfl/fl e AKP270/fl si sono sempre raggruppati insieme, e sono stati separati dagli organoidi derivati da adenomi Apc-mutanti (Cont1, Fig. 6 supplementare) o dall’epitelio normale del colon (Cont2, Fig. 6 supplementare).

Per verificare se ci fossero differenze dimostrabili nei modelli di espressione genica tra CRC umani con mutazioni missense e nulle TP53, abbiamo analizzato i conteggi normalizzati trasformati in log2 dai dati RNA-seq per CRC in The Cancer Genome Atlas (TCGA), confrontando 9 tumori con TP53 codone 273 mutazioni missense a 36 tumori con mutazioni nulle (causate da frame shift, sito di splice, e mutazioni nonsense, vedi Tabella supplementare 3 per i dettagli) da due campioni T-test per 20531 geni. Abbiamo trovato solo 244 geni con P < 0.01 e 30 geni con P < 0.001, che erano solo leggermente più del numero previsto dal caso (205 e 20.5, rispettivamente, Tabella 4). TP53 stesso ha dato la differenza più significativa nell’espressione genica, essendo quasi 5 volte inferiore in media nei tumori con mutazioni nulle vs mutazioni TP53 codone 273 (Tabella supplementare 4, P = 2 × 10-10). Ancora una volta, abbiamo trovato poca separazione dei due gruppi di tumori in analisi PC (Fig. 7 supplementare). Coerentemente con la firma trascrizionale simile, abbiamo adattato i modelli di Cox proporzionali a 43 pazienti con dati di sopravvivenza, utilizzando l’età, lo stadio e lo stato TP53 nel modello, e non ha trovato alcuna associazione significativa tra il risultato del paziente e lo stato di mutazione TP53 (mutazione missenso R273 vs mutazione nulla, Tabella supplementare 5, P = 0,67 dal test di Wald). Vale la pena ricordare che con solo 7 morti tra questi pazienti, il potere di rilevare le differenze era piuttosto basso. Infine, abbiamo guardato l’intersezione dei geni che danno P < 0,05 in uno qualsiasi dei tre set di dati sopra descritti (cioè, tumori del colon umano e del topo, organoidi del colon del topo) che è cambiato nella stessa direzione per Trp53/TP53 missenso vs confronto null. Nella tabella supplementare 4 mostriamo i geni che hanno dato P < 0,05 e fold-cambiamenti di almeno 1,3 in qualsiasi due dei tre set di dati. Abbiamo trovato solo Trp53/TP53 che è cambiato nella stessa direzione in tutti e tre gli studi (Tabella supplementare 4; le statistiche dettagliate per ogni gene in tutti e tre i set di dati sono disponibili nella nostra serie pubblica GEO). Nel complesso, le nostre analisi di espressione genica per i CRC murini e umani indicano che i tumori del colon con mutazioni missenso o nulle R270/R273 Trp53/TP53 hanno profili di espressione genica molto simili, il che è coerente con l’assenza di qualsiasi differenza importante nelle caratteristiche biologiche nei tumori del colon e nei fenotipi derivanti in vivo nei topi AKP270/fl e AKPfl/fl.