Materiali

Duloxetina (DLX) di grado puro è stata gentilmente fornita come campione omaggio da Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, India. Hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) gradi 100 M, 4CM, e 15 M CR sono stati generosamente forniti da Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, India. Tutti gli altri prodotti chimici di laboratorio e reagenti utilizzati nello studio erano di grado analitico reagente. Durante lo studio è stata usata acqua bidistillata. Il polietilenglicole 400 è stato acquistato da S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, India. L’idrogeno fosfato disodico, il diidrogeno fosfato di potassio e l’idrossido di sodio sono stati acquistati da CDH Ltd., New Delhi, India. Etanolo, assoluto, è stato ottenuto da Changshu Yangyuan Chemical, Cina. n-Octanol è stato acquistato da E-Merck (India) Ltd., Mumbai, India. Membrana di dialisi150 è stato acquistato da Hi Media Laboratories Ltd., Mumbai. Tutti i materiali e le polveri sono stati conservati sotto vuoto a temperatura ambiente.

Apparecchiature

Spettri UV sono stati registrati su Perkin Elmer lambda 15 UV / visibile spettrofotometro nella gamma UV / visibile di 190 a 600 nm. Il gruppo cella di diffusione Franz è stato procurato da Permegear, Inc. Spettrofotometro a infrarossi FT-IR-8300 è stato ottenuto da Perkin Elmer PE RX 1 spettrofotometro FTIR. Gli spettri della calorimetria differenziale a scansione (DSC) sono stati ottenuti utilizzando il modello DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). La centrifuga di ricerca era di REMI Equipments, Mumbai, India. Il misuratore di pH CyberScan pH 510 è stato procurato da Eutech Instruments, India.

Studi di preformulazione

Preparazione di fosfato tampone salino pH 7.4

0,19 g di diidrogeno fosfato di potassio, 2,38 g di ortofosfato disodico e 8,0 g di NaCl sono stati sciolti in acqua distillata e il volume è stato portato a 1000 ml con acqua distillata. Il pH del tampone è stato regolato a 7,4.

Quantificazione della duloxetina cloridrato

Il contenuto di duloxetina è stato analizzato mediante analisi spettrofotometrica UV in tampone fosfato pH 7,4. La scansione della soluzione stock è stata effettuata nell’intervallo UV da 190 a 400 nm. Il λ max è stato ottenuto alla lunghezza d’onda di 289 nm. La soluzione stock A (250 μ/ml) di duloxetina cloridrato è stata preparata sciogliendo 0,0250 g del farmaco in soluzione salina tampone fosfato (pH 7,4) a 100 ml. Inoltre, diluizioni seriali che vanno da 1 μg/ml a 100 μg/ml di duloxetina sono state preparate diluendo le soluzioni stock A e B con tampone fosfato (pH 7.4). I valori di assorbanza delle diluizioni sono stati notati a λ max di DLX, cioè 289 nm contro la soluzione salina tamponata al fosfato (pH 7,4) presa come bianco, e la curva di calibrazione è stata tracciata.

Caratterizzazione fisico-chimica della duloxetina cloridrato

Determinazione del punto di fusione

Una piccola quantità di duloxetina cloridrato è stata presa in un tubo capillare (fuso ad un’estremità) e posta in un apparecchio per il punto di fusione, e la temperatura di fusione è stata registrata. Tre misure separate sono state prese per lo scopo, e il loro valore medio è stato ottenuto.

Determinazione del coefficiente di partizione

Il coefficiente di partizione della duloxetina cloridrato è stato determinato nel sistema ottanolo-acqua (Wells 2002). Le due fasi sono state prese in un rapporto 1:1 v/v e reciprocamente saturate in un agitatore a bagno d’acqua a 37 °C, e le due fasi sono state poi separate. Dieci milligrammi di farmaco sono stati aggiunti a una miscela di 20 ml di fase organica pre-saturata e 20 ml di acqua pre-saturata e agitata per 10 min. Le beute sono state poi tenute a 37 °C per 24 ore con agitazione intermittente. La miscela è stata successivamente centrifugata per separare le fasi acquosa e non acquosa. Le due fasi sono state analizzate separatamente per la duloxetina in modo spettrofotometrico. Il coefficiente di partizione del farmaco “K o/w” è stato poi calcolato dal rapporto tra la concentrazione del farmaco in ottanolo e la fase acquosa.

Studi di interazione farmaco-polimero

Spettroscopia all’infrarosso con trasformazione di Fourier

Spettroscopia all’infrarosso con trasformazione di Fourier (FTIR) è stata impiegata per analizzare il farmaco DLX puro, la miscela fisica di DLX e HPMC (15 CR, 100 M, e 4 M), così come i cerotti transdermici caricati con il farmaco utilizzando il metodo delle pastiglie KBr. Tutti i campioni sono stati scansionati da 400 a 4000 cm-1.

Calorimetria differenziale a scansione

Le possibili interazioni tra il farmaco e il polimero utilizzato sono state analizzate dai termogrammi DSC del farmaco puro duloxetina cloridrato e della formulazione (HPMC + farmaco) ottenuti utilizzando il modello DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Tutti i campioni sono stati sigillati in padelle di alluminio a fondo piatto e riscaldati in un intervallo di temperatura da 25 a 300 °C con un tasso di aumento di 5 °C/min.

Fabbricazione di cerotti transdermici

I film transdermici contenenti duloxetina cloridrato sono stati colati su vetrini per evaporazione con solvente usando diversi gradi (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) di HPMC in presenza e assenza di un plastificante. Il PEG 400 (5%) è stato usato come plastificante in tutti i casi. La tabella 1 mostra le formule e la composizione per i diversi tipi di cerotti formulati. La duloxetina cloridrato (60 mg) è stata sciolta in una miscela di solventi acqua-metanolo (7:3). La matrice del farmaco è stata preparata sciogliendo concentrazioni variabili (1% e 1,5% w/v) di HPMC nello stesso sistema di solventi. La soluzione è stata tenuta indisturbata per 24 ore. Poi, con l’aiuto di siringa e ago, la soluzione è stata versata in un anello di vetro di 5,0 cm di diametro posto sulla superficie di vetro. Il solvente è stato lasciato evaporare per 6 ore in un forno termostatato a 60 °C. I cerotti sono stati conservati in un contenitore ermetico in condizioni ambientali per 7 giorni prima dell’uso.

Tabella 1 Formule e composizione dei sistemi transdermici formulati di duloxetina HCl

Valutazione dei cerotti transdermici

Apparenza fisica

Tutti i cerotti preparati sono stati ispezionati visivamente per colore, chiarezza, flessibilità e morbidezza.

Spessore del cerotto

Lo spessore dei cerotti caricati con il farmaco è stato misurato utilizzando un micrometro a vite in tre punti diversi sui cerotti. I valori medi e la deviazione standard delle tre letture sono stati calcolati per ogni cerotto caricato con il farmaco.

Uniformità del peso

I cerotti sono stati sottoposti al test di variazione del peso pesando tutti i cerotti su una bilancia digitale. Le determinazioni sono state effettuate in triplicato per ogni formulazione. Sono stati poi calcolati il peso medio e i valori di deviazione standard.

Studio di planarità

Lo studio di planarità è stato condotto per valutare che i cerotti transdermici preparati abbiano una superficie liscia e non si restringano con il tempo. Tre strisce longitudinali sono state tagliate dal film in tre porzioni diverse. La lunghezza di ogni striscia è stata misurata e la variazione di lunghezza a causa della non-uniformità della planarità è stata determinata determinando la costrizione percentuale, con lo 0% di costrizione equivalente al 100% di planarità. L’attrito percentuale è stato ottenuto come (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Qui, l 1 è la lunghezza iniziale di ogni striscia, e l 2 è la lunghezza finale di ogni striscia.

Folding endurance

Questo test è stato effettuato per controllare l’efficienza del plastificante e la forza del patch preparato utilizzando diversi polimeri. La resistenza alla piegatura è definita come il numero di pieghe necessarie per rompere qualsiasi patch polimerico. La resistenza alla piegatura è stata misurata manualmente piegando ripetutamente una piccola striscia della pellicola (2 × 2 cm) nello stesso punto fino a quando non si è rotta. Il numero di volte in cui il cerotto poteva essere piegato nello stesso punto senza rompersi ha dato il valore della resistenza alla piegatura. Tre patch di ogni tipo sono state prese per il test.

Assorbimento percentuale dell’umidità/assorbimento del vapore acqueo

Il test di assorbimento percentuale dell’umidità è stato effettuato per controllare la stabilità fisica e l’integrità dei film in condizioni di elevata umidità. Le pellicole preparate (3,14 cm2) sono state pesate individualmente con precisione ed esposte all’85 ± 5% di umidità relativa in un essiccatore contenente 100 ml di soluzione satura di cloruro di potassio a temperatura ambiente. Durante questo periodo, le pellicole sono state pesate a intervalli regolari di 24, 48 e 72 ore. La percentuale di assorbimento dell’umidità è stata determinata dalla seguente formula:

Contenuto percentuale di umidità

Questo test è stato effettuato anche per verificare l’integrità delle pellicole in condizioni di siccità. Le singole pellicole transdermiche (di area specificata) sono state tenute in un essiccatore contenente cloruro di calcio anidro fuso a temperatura ambiente. Durante questo periodo, le pellicole sono state pesate a intervalli regolari di 24, 48 e 72 ore. Il contenuto percentuale di umidità è stato determinato utilizzando la seguente formula:

Trasmissione del vapore acqueo

Il tasso di trasmissione del vapore acqueo (WVTR) è definito come la quantità di umidità trasmessa attraverso l’unità di superficie della pellicola nell’unità di tempo. Come celle di trasmissione sono state utilizzate delle fiale di vetro di uguale volume e diametro. Le celle sono state lavate adeguatamente e asciugate in forno. Poi, circa 1 g di cloruro di calcio fuso anidro è stato messo in ogni fiala, e il cerotto è stato fissato sopra l’orlo della fiala con l’aiuto di un nastro adesivo. Queste fiale sono state poi pesate e messe in essiccatori contenenti una soluzione satura di cloruro di potassio per mantenere l’84% di umidità relativa. Queste cellule sono state rimosse dagli essiccatori e pesate dopo il 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6° e 7° giorno. Il tasso di trasmissione del vapore acqueo è stato determinato come segue:

$$ W.\ V.\ T. = WL/S $$

dove W è il peso del vapore acqueo trasmesso, L è lo spessore della toppa e S è la superficie esposta in centimetro quadrato.

PH superficiale

I patch sono stati tenuti a contatto con 0,5 ml di acqua bidistillata per 1 ora in tubi di vetro e sono stati lasciati gonfiare. Un elettrodo di vetro combinato è stato portato vicino alla superficie del cerotto e le letture del pH sono state prese dopo aver permesso un periodo di equilibrio di 1 min.

Determinazione del contenuto del farmaco

Pezzi di dimensioni 2 × 2 sono stati tagliati da ogni tipo di formulazione e messi in 100 ml di soluzione salina tamponata con fosfato pH 7.4. Il contenuto è stato agitato magneticamente per 2 ore. La soluzione è stata poi filtrata attraverso carta da filtro Whatman (0,45 μ) e diluita adeguatamente con tampone fosfato salino pH 7,4. La soluzione è stata poi analizzata per la sua assorbanza a 289 nm usando il cerotto placebo come bianco. Dai valori di assorbanza, è stato determinato il contenuto di droga.

Rilascio di droga in vitro

La cella di diffusione di Franz è stata impiegata per la caratterizzazione in vitro delle formulazioni transdermiche. Si tratta di un metodo affidabile per la previsione del trasporto del farmaco attraverso la pelle da formulazioni topiche. Il compartimento recettore della cella di diffusione è stato riempito con 30,0 ml di soluzione salina tamponata al fosfato (pH 7,4), e gli studi di rilascio del farmaco in vitro sono stati eseguiti utilizzando una membrana sintetica in cellophane. Le formulazioni preparate sono state applicate sulla membrana nel compartimento donatore e sono state distribuite uniformemente sulla membrana di cellophane. L’assemblaggio è stato mantenuto costantemente a 37,0 ± 2,0 °C a 50 rpm. I campioni (1.0 ml aliquote) sono stati poi prelevati a intervalli di tempo adeguati (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 6, 12, e 24 h) e riempito con una quantità di mezzo per mantenere il volume della fase recettore a 30 ml. I campioni sono stati analizzati spettrofotometricamente a 289 nm.

Permeazione dei farmaci/studi ex vivo

Gli studi di permeazione dei farmaci sono stati eseguiti utilizzando la pelle di ratti Wistar maschi. I ratti sono stati sacrificati per dislocazione spinale. I campioni di pelle sono stati tagliati, rimossi e lavati con soluzione salina normale. Il grasso aderente e il tessuto connettivo sono stati rimossi con una pinza smussata. La pelle è stata tenuta in soluzione salina normale per 6 ore. I peli della pelle del ratto sono stati rasati con cura per evitare danni periferici. Il compartimento del recettore della cella di diffusione Franz è stato riempito con 30 ml di soluzione salina tampone fosfato (pH 7,4). Le formulazioni preparate sono state applicate sulla pelle del ratto nel compartimento del donatore. La temperatura dell’assemblaggio è stata mantenuta costantemente a 37 ± 2 °C e la velocità di agitazione controllata a 50 rpm. I campioni (aliquote da 5 ml) sono stati prelevati a intervalli di tempo adeguati (0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 24 ore) e sostituiti con la stessa quantità di mezzo per mantenere il volume della fase recettoriale a 30 ml. I campioni sono stati analizzati spettrofotometricamente a λ max di 289 nm.

Studi di irritazione cutanea

L’autorizzazione etica per la manipolazione degli animali da esperimento è stata ottenuta dal Comitato etico istituzionale per gli animali (IAEC), Panjab University, Chandigarh, e gli studi sono stati condotti come da protocollo approvato.

I ratti Wistar albini sono stati alloggiati in gabbie, con eccesso libero di dieta standard di laboratorio e acqua. La pelle addominale dorsale dei ratti è stata rasata con cura evitando danni periferici, prima di 24 ore di condurre lo studio. Il cerotto transdermico è stato applicato sulla pelle nuda e coperto con un nastro microporoso non sensibilizzante. Una soluzione acquosa di formalina allo 0,8% v/v è stata applicata come irritante cutaneo standard. Gli animali sono stati applicati con un nuovo cerotto ogni giorno fino a 7 giorni. La formulazione è stata rimossa dopo 7 giorni; il punteggio dell’eritema è stato registrato ed è stato confrontato con lo standard. Il punteggio dell’eritema è stato letto e registrato con il metodo di punteggio Draize (Draize et al. 1944) come punteggio 0 per nessun eritema, punteggio 1 per eritema molto leggero (rosa chiaro), punteggio 2 per eritema ben definito (rosa scuro), punteggio 3 per eritema da moderato a grave (rosso chiaro), e punteggio 4 per eritema grave (rosso scuro).

Analisi dei dati

Per l’ennesimo campione, V s è il volume del campione prelevato, V t è il volume totale del mezzo recettore, C c è la concentrazione corretta, C u è la concentrazione non corretta dell’ennesimo campione e C i è la concentrazione non corretta. Inoltre, la concentrazione corretta è stata utilizzata per calcolare i valori della quantità di droga rilasciata e la percentuale di droga rilasciata in ogni momento del campionamento insieme al tasso di rilascio della droga.

Il coefficiente di permeabilità è la velocità del passaggio della droga attraverso la membrana/pelle in μg/cm2/h. Il coefficiente di permeabilità è stato calcolato dalla pendenza del grafico della percentuale di farmaco trasportato vs tempo come P = pendenza × V d/S

Qui, V d è il volume della soluzione donatrice in millilitri, e S è la superficie del tessuto in centimetro quadrato.

Flusso (valore J) è definito come la quantità di materiale che scorre attraverso una barriera di sezione unitaria in tempo unitario. È calcolato da: