Definizione dell’unità
Un’unità di attività delle endonucleasi di restrizione è definita come la quantità di enzima richiesta per produrre una completa digestione di 1 µg di DNA substrato (o frammenti) in un volume di reazione totale di 50 µl in 60 minuti in condizioni di test ottimali come indicato per ciascuna endonucleasi di restrizione.
Determinazione del volume di attività delle endonucleasi di restrizione
I saggi di attività delle endonucleasi di restrizione vengono eseguiti aggiungendo diverse diluizioni dell’enzima al tampone di saggio appropriato contenente 1 µg di DNA substrato. Dopo un’incubazione di 60 minuti alla temperatura appropriata, la digestione viene interrotta e i campioni di DNA vengono visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio/etidio bromuro. La soluzione enzimatica più diluita che dà una digestione completa viene usata per calcolare l’attività in unità/µl.
Si prega di notare che l’attività dipende dal substrato e quando si lavora con un nuovo substrato, l’enzima dovrebbe essere titolato per determinare l’attività effettiva o attesa.
Controlli di qualità
I risultati di tutti i test di controllo di qualità sono riportati sulla scheda tecnica fornita con ogni enzima.
Saggio di sovradigestione
Un saggio di sovradigestione è stato usato come determinazione qualitativa della purezza dell’enzima e della mancanza di DNasi non specifiche. Nel test di sovradigestione, quantità crescenti di ciascuna endonucleasi di restrizione (solitamente 10, 20, 30, 40, 50 unità) vengono aggiunte a una serie di provette contenenti 1 µg di DNA substrato. Dopo un’incubazione di 20 ore nelle condizioni di test raccomandate, il numero massimo di unità che danno un modello di bandeggio chiaro, nitido e normale viene determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio/etidio bromuro.
Per superare il test, l’enzima deve produrre un modello di bandeggio inalterato in condizioni di sovradigestione fino a 600 volte (unità x ore) rispetto a un digest di 2 volte. Se l’enzima mostra un’attività “stellare” ad un eccesso funzionale inferiore a 600 volte, la descrizione del prodotto include informazioni sull’eccesso funzionale al quale l’attività “stellare” non si verifica.
Saggio per endonucleasi aspecifiche
Per testare la contaminazione non specifica dell’endonucleasi, ogni endonucleasi di restrizione viene incubata con un substrato plasmidico supercoiled privo della sequenza di riconoscimento dell’endonucleasi di restrizione. Una singola scalfittura aspecifica nel DNA RF I lo converte nella forma RF II (cerchio scalfito). Quantità crescenti di enzima (di solito 10, 20, 30, 40, 50 unità) vengono aggiunte a una serie di provette contenenti 1 µg di DNA RF I (forma superavvolta). Dopo un’incubazione di 20 ore nelle condizioni di test raccomandate, le due forme vengono distinte su gel di agarosio e viene determinata la percentuale di conversione da RF I a RF II.
Saggio di legatura e ritaglio
Un saggio di legatura è stato usato per determinare la purezza funzionale del DNA dopo la digestione dell’enzima di restrizione. Il DNA del substrato viene completamente digerito con un eccesso di 10 e 50 volte dell’endonucleasi di restrizione nel tampone appropriato, legato con la DNA ligasi T4 e ritagliato con lo stesso enzima di restrizione. I DNA tagliati, legati e ritagliati vengono analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio/bromuro di etidio. Un modello di bande normale indica 5 e 3 termini intatti e l’assenza di nucleasi o fosfatasi contaminanti.
Stabilità
Tutte le endonucleasi di restrizione Jena Bioscience vengono riesaminate ogni 4-6 mesi. Questo processo ci permette di garantire la piena attività enzimatica e le prestazioni ottimali di ogni enzima che spediamo. Grazie agli eccellenti risultati di questo test, abbiamo esteso le date di scadenza della maggior parte dei nostri enzimi a 18 mesi.