Effetto antigenotossico di estratti di Trametes spp. contro il danno al DNA sui globuli bianchi periferici umani

Abstract

Le specie di Trametes sono state usate per migliaia di anni nella medicina tradizionale e convenzionale per il trattamento di vari tipi di malattie. L’obiettivo era quello di valutare i possibili effetti antigenotossici del micelio e degli estratti del basidiocarpo di specie Trametes selezionate e di valutare la dipendenza dal loro potenziale antiossidante. Le specie studiate sono state Trametes versicolor, T. hirsuta e T. gibbosa. I potenziali antigenotossici degli estratti sono stati valutati sui globuli bianchi periferici umani con estratti di basidiocarpo e micelio delle specie. Il test della cometa alcalina è stato utilizzato per rilevare le rotture del filamento di DNA e i siti alcalini-labili, così come l’entità della migrazione del DNA. Il test DPPH è stato utilizzato per stimare le proprietà antiossidative degli estratti. Gli estratti del corpo fruttifero di T. versicolor e T. gibbosa così come gli estratti di T. hirsuta, tranne quello a 20,0 mg/mL, non erano agenti genotossici. L’estratto di T. versicolor ha avuto a 5,0 mg/mL il maggiore effetto antigenotossico sia nel pre che nel post trattamento dei leucociti. Gli estratti di micelio delle tre specie non avevano alcuna attività genotossica e un effetto antigenotossico significativo contro i danni al DNA indotti dall’H2O2, sia nel pre che nel post trattamento. I risultati suggeriscono che gli estratti di queste tre specie potrebbero essere considerati come forti agenti antigenotossici in grado di stimolare la risposta genoprotettiva delle cellule.

1. Introduzione

I funghi sono stati a lungo utilizzati come cibo ma anche nella medicina tradizionale sia del mondo occidentale che orientale. Anche se numerosi funghi sono riconosciuti come cibo sano, il loro grande potenziale farmacologico è ancora sottoutilizzato. Quasi 60 specie di Trametes sono note per abitare il mondo, ma solo alcune di esse sono state esaminate per le loro proprietà medicinali. Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd è la specie medicinale più famosa del genere. Questa specie, i cui nomi popolari sono Turkey Tail nelle culture occidentali, Yun-Zhi (fungo a forma di nuvola) in Cina, o Kawaratake (fungo sulla riva del fiume) in Giappone, è stata usata per migliaia di anni nella medicina tradizionale, in particolare in Asia. Secondo il Compendio della Materia Medica Cinese, scritto durante la dinastia Ming, sono stati registrati più di 120 ceppi di T. versicolor e nella pratica medica tradizionale cinese questo fungo è considerato utile per rimuovere le tossine, rafforzare, aumentare l’energia, migliorare la funzione del fegato e della milza e migliorare la risposta immunitaria, specialmente quando viene essiccato, macinato e preparato in tè. Tutte queste proprietà erano considerate molto utili nella medicina popolare per l’uso cronico dei preparati di Trametes spp. Nella medicina convenzionale la specie è utilizzata principalmente per il trattamento di vari tipi di cancro, ma anche per l’epatite cronica, l’artrite reumatoide, e le infezioni del tratto respiratorio, urinario e digestivo, che è stato confermato da numerosi studi. Inoltre, sono stati riportati forti effetti antivirali di alcuni polisaccaropeptidi isolati da T. versicolor e una significativa attività antiossidante degli estratti dei corpi fruttiferi di Trametes spp. Questi effetti si basano principalmente sulla produzione del polisaccaride krestin (PSK) e di vari complessi polisaccaride-peptide, composti che riducono le metastasi tumorali e stimolano la produzione di interleuchina-1 nelle cellule umane.

L’abbondante presenza di radicali liberi nell’ambiente è associata alla comparsa di stress ossidativo che è alla base dell’invecchiamento e dell’inizio e del progresso di varie malattie e disturbi di cui soffre e muore gran parte della popolazione mondiale. Il DNA è più sensibile ai danni ossidativi di altre macromolecole. I danni al DNA, come le rotture dei filamenti, potrebbero essere indotti da vari agenti tra cui l’H2O2 produce un effetto genotossico. È noto che questi danni possono influenzare la risposta immunitaria non solo nelle malattie infiammatorie ma anche nei tumori. Il test della cometa è un test ben consolidato ed efficace di alta sensibilità che è stato utilizzato per esaminare i danni al DNA e può essere applicato per valutare il potenziale genotossico e protettivo di diversi prodotti naturali.

Un’attività genoprotettiva degli estratti di funghi basata sulla riduzione dei danni ossidativi del DNA può anche giocare un ruolo significativo nella prevenzione e nel trattamento di diverse malattie e disturbi menzionati ma pochissimi studi fino ad oggi l’hanno considerata come possibile strumento d’azione in diverse terapie. Pertanto l’obiettivo dello studio è stato quello di valutare gli effetti antigenotossici degli estratti di micelio e basidiocarpo di specie selezionate di Trametes sui globuli bianchi periferici umani e di valutare la dipendenza dal loro potenziale antiossidante.

2. Materiali e metodi

2.1. Organismi e condizioni di coltivazione

Le colture di Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301, e T. gibbosa BEOFB 310 sono state isolate da corpi fruttiferi raccolti in Serbia e mantenute su terreno Malt agar nella collezione di colture dell’Istituto di Botanica, Facoltà di Biologia, Università di Belgrado (BEOFB).

L’inoculo è stato preparato mediante inoculazione di 100,0 mL di terreno sintetico (glucosio, 10.0 g L-1; NH4NO3, 2.0 g L-1; K2HPO4, 1.0 g L-1; , 0.4 g L-1; , 0.5 g L-1; estratto di lievito, 2.0 g L-1; pH 6.5) con 25 dischi miceliali (Ø 0.5 cm, da una cultura di 7 giorni da agar di malto) in fiasche da 250 mL e incubazione su un agitatore rotante a 100 rpm, a temperatura ambiente (°C) per 7 giorni. La biomassa risultante è stata lavata e omogeneizzata con 100,0 mL di acqua distillata sterile (dH2O) in un frullatore da laboratorio. La biomassa omogeneizzata (30,0 mL) è stata utilizzata per l’inoculazione di 500,0 mL di terreno sintetico modificato (con glucosio presente a 65,0 g L-1). La coltivazione sommersa è stata effettuata in fiasche da 1000 mL a temperatura ambiente su un agitatore rotante per 21 d. La biomassa ottenuta è stata filtrata, lavata 3 volte con dH2O su un agitatore magnetico, ed essiccata a 50°C fino a peso costante.

2.2. Preparazione degli estratti fungini

Il corpo fruttifero e il micelio essiccati (3,0 g) sono stati estratti mescolando con 90,0 mL di etanolo al 96% a 30°C per 72 ore. Gli estratti risultanti sono stati centrifugati (20°C, 3000 rpm, 15 min) e i surnatanti sono stati filtrati attraverso carta da filtro Whatman numero 4, concentrati sotto pressione ridotta in un evaporatore rotante (BÜCHI R-114, Svizzera) a 40°C fino a secchezza, e ridisciogliuti in etanolo al 96% per il test antiossidante o in acqua per il test antigenotossico fino a una concentrazione iniziale di 20,0 mg mL-1. La resa dell’estrazione è stata espressa come percentuale sulla base del peso secco.

2.3. Attività genoprotettiva

2.3.1. Soggetti

I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti tramite venipuntura da tre donatori sani di età inferiore ai 25 anni. I partecipanti allo studio erano non fumatori e non alcolisti, non ricevevano alcuna terapia o farmaci e non assumevano integratori alimentari.

2.3.2. Disegno dello studio

La genotossicità di tutti gli estratti e delle concentrazioni (20.0, 10.0, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, e 0.312 mg mL-1) è stata studiata tramite il trattamento dei globuli bianchi periferici umani a 37°C per 30 minuti allo scopo di valutare i danni al DNA. Normalmente vengono utilizzati i globuli bianchi, perché sono ottenuti in modo relativamente non invasivo, non richiedono la disaggregazione dei tessuti e si comportano bene nel test della cometa. Il trattamento con tampone fosfato (PBS) a 37°C per 30 min è stato usato come controllo positivo e il trattamento con 25.0 μM H2O2 in ghiaccio per 15 min come controllo negativo.

Sono stati usati due protocolli indipendenti per valutare il potenziale antigenotossico degli estratti, usando il pretrattamento e il posttrattamento con gli estratti. Nel pretrattamento, le cellule sono state incubate con gli estratti a 37°C per 30 minuti, poi lavate con PBS, ed esposte a H2O2 per 15 minuti. Nel post-trattamento, le cellule sono state trattate con H2O2 in ghiaccio per 15 minuti, sciacquate con PBS, e successivamente trattate con le sette concentrazioni di estratto a 37°C per 30 minuti. Dopo ogni trattamento, le cellule sono state lavate con PBS. L’incubazione con PBS a 37°C per 30 min è stato il controllo negativo e il trattamento con 25.0 μM H2O2 in ghiaccio per 15 min ha rappresentato il controllo positivo.

Tre repliche sono state eseguite per ogni esperimento e 100 nuclei sono stati analizzati per ciascuno.

2.3.3. Il test di elettroforesi su gel di singole cellule

Il test della cometa è stato eseguito come descritto da Singh et al. Il test della cometa alcalina è in grado di rilevare rotture del filamento di DNA e siti alcalini-labili, e l’entità della migrazione del DNA indica il grado di danno al DNA nelle cellule.

I campioni di sangue intero (6,0 μL) sono stati sospesi in agarosio allo 0,67% a basso punto di fusione (LMP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e pipettati su vetrini da microscopio superfrosted pre-rivestiti con uno strato di 1% normale punto di fusione agarosio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), diffondere utilizzando un vetrino coprioggetto, e mantenuto in ghiaccio per 5 minuti per solidificare. Dopo aver rimosso delicatamente i vetrini coprioggetto, le sospensioni cellulari sui vetrini sono state trattate con gli estratti e H2O2 come descritto sopra. Dopo i trattamenti, tutti i vetrini sono stati coperti con il terzo strato di agarosio 0,5% LMP e di nuovo è stato permesso di solidificare in ghiaccio per 5 minuti. Dopo la rimozione dei vetrini, i vetrini sono stati posti in soluzione lisante fredda (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100, e 10% dimetilsolfossido, pH 10,0 regolata con NaOH) a 4 ° C durante la notte e poi sottoposti a elettroforesi e colorazione con bromuro di etidio. Le comete sono state osservate e analizzate utilizzando un microscopio Olympus ×50 (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Germania), dotato di un dispositivo per la registrazione della fluorescenza con ingrandimento 100x. La valutazione dei danni al DNA è stata eseguita come descritto da Anderson et al. Vale a dire, le cellule sono state classificate a occhio in cinque categorie corrispondenti alle seguenti quantità di DNA nella coda: (A) nessun danno, <5%; (B) danno di basso livello, 5-20%; (C) danno di livello medio, 20-40%; (D) danno di alto livello, 40-95%; (E) danno totale, >95% (Figura 1). L’analisi è stata eseguita su 100 cellule selezionate a caso per soggetto (50 cellule da ciascuno dei 2 vetrini replicati). Per ottenere un’analisi semiquantitativa dei dati, il danno al DNA è stato caratterizzato come la migrazione del DNA oltre il 5% (B + C + D + E classi cometa).

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Figura 1

Categorizzazione del danno al DNA corrispondente alla quantità di DNA nella coda.

2.4. Attività antiossidante

2.4.1. DPPH- Assay

L’attività antiossidante è stata definita misurando lo sbiancamento della soluzione di metanolo di colore viola del radicale stabile 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl () . Gli effetti di scavenging sono stati misurati spettrofotometricamente (CECIL CE 2501) a 517 nm e calcolati usando l’equazione: dove è l’assorbanza del controllo negativo (miscela di reazione senza estratto) ed è l’assorbanza della miscela di reazione.

La concentrazione dell’estratto (mg di estratto/mL) che fornisce il 50% di riduzione (EC50) è stata ottenuta per interpolazione dall’analisi di regressione lineare. Tutte le misurazioni sono state effettuate in triplicato per l’analisi statistica. L’antiossidante commerciale, il butilidrossianisolo (BHA), in un intervallo di concentrazione di 20,0 mg mL-1-0,02 mg mL-1, è stato usato come controllo positivo.

2.4.2. Determinazione del contenuto totale di fenoli

I composti fenolici totali negli estratti miceliali sono stati stimati con il reagente di Folin-Ciocalteu secondo il metodo di Singleton e Rossi, usando l’acido gallico come standard. La concentrazione è stata determinata come μg di equivalenti di acido gallico (GAE) per mg di estratto secco, utilizzando un’equazione che è stata ottenuta da un grafico standard dell’acido gallico come

2.4.3. Determinazione del contenuto totale di flavonoidi

Il contenuto totale di flavonoidi è stato determinato con i metodi di Park et al. usando la quercetina come standard. La quantità è stata espressa come μg di quercetina equivalente (QE) per mg di estratto secco, utilizzando un’equazione ottenuta da un grafico standard della quercetina idrata come

2.5. Analisi statistica

I risultati sono stati espressi come media ± errore standard dei dati ottenuti da tre misurazioni parallele. L’analisi della varianza (ANOVA) a una via è stata eseguita utilizzando il software STATISTIKA, versione 5.0 (StatSoft Inc.) per testare eventuali differenze significative. valori inferiori a 0,01 sono stati considerati statisticamente significativi. L’analisi statistica dei dati del test della cometa è stata eseguita con il test χ2 utilizzando il software Statgraph 4.2. Per eseguire il test χ2, i risultati dei tre esperimenti sono stati raggruppati e abbiamo valutato il numero totale di cellule con danni al DNA. Una differenza a è stata considerata statisticamente significativa.

3. Risultati e discussione

3.1. Rendimento di estrazione

I rendimenti di estrazione della biomassa del micelio per tutte e tre le specie erano significativamente più alti rispetto al corpo fruttifero (). T. gibbosa ha avuto la più alta resa di estrazione dalla biomassa del micelio essiccato (34,6%) e la più bassa resa dai corpi fruttiferi essiccati (2,2%). La resa di estrazione del corpo fruttifero più alta del 6,67% è stata trovata in T. versicolor, la cui resa di estrazione del micelio era dell’8,0%. I rendimenti in T. hirsuta sono stati del 12,0% (per il micelio) e del 2,85% (per il corpo fruttifero). Le differenze nell’efficienza di estrazione tra le specie, sia per il micelio che per il corpo fruttifero, erano statisticamente significative ().

Rapporti precedenti hanno mostrato la dipendenza dell’estraibilità della biomassa da specie, ceppo e solvente. Così, Ren et al. hanno trovato che le rese di estrazione del basidiocarpo di T. gibbosa erano 1,22% per l’estratto di etere di petrolio, 6,44% per l’acetato di etile e 9,2% per gli estratti di metanolo. Il metanolo era anche un buon solvente per il basidiocarpo di T. versicolor, la cui resa variava tra il 4,1% e il 9,16%. Sulla base dei nostri risultati, si può concludere che gli alcoli sono i migliori solventi, ma l’etanolo è più debole del metanolo.

3.2. Attività genoprotettiva

Poiché tutti i donatori di sangue erano in buona salute, di età simile e senza farmaci, l’analisi statistica non ha mostrato chiare differenze nelle loro risposte agli estratti. Pertanto, i risultati dei tre esperimenti sono stati raggruppati. Il trattamento dei leucociti del sangue periferico con H2O2 ha causato una rapida e potente induzione di rotture a singolo filamento nel DNA nucleare, che era visibile nel test della cometa come migrazione del DNA.

I nostri risultati hanno dimostrato che gli estratti del corpo fruttifero di T. versicolor da 0,312 a 20.0 mg mL-1 non ha causato un aumento significativo del numero totale di cellule danneggiate dal DNA rispetto al controllo positivo, il che dimostra chiaramente che l’estratto testato non era un agente genotossico (Figura 2(a) (A)). Anche la distribuzione (valore) del danno totale al DNA era la stessa del controllo positivo. D’altra parte, questi estratti hanno mostrato effetti protettivi contro H2O2 sia nel pre che nel post trattamento dei leucociti (Figura 2(a) (B, C)). L’estratto a 5,0 mg mL-1 ha avuto l’effetto maggiore e a 20,0 mg mL-1 l’effetto minore in entrambi i trattamenti. Il valore del danno totale al DNA è statisticamente diminuito rispetto al controllo positivo in tutte le concentrazioni ().

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Figura 2

Effetto degli estratti del corpo fruttifero di (a) Trametes versicolor, (b) T. hirsuta, e (c) T. gibbosa: (A) genotossico, (B) antigenotossico, pretrattamento, e (C) antigenotossico, posttrattamento. Tre esperimenti indipendenti con tre repliche per esperimento sono stati fatti e valutati dal test della cometa. Sono stati analizzati 100 nuclei per ogni replica. I dati rappresentano il numero totale di cellule con danni al DNA.

T. hirsuta corpo fruttifero estratto a tutte le concentrazioni tranne 20,0 mg mL-1 non ha mostrato alcuna attività genotossica come il livello di danno totale del DNA non era statisticamente superiore a quello del controllo positivo (Figura 2 (b) (A)). Tuttavia, alla concentrazione di 20,0 mg mL-1, l’effetto genotossico e il danno totale al DNA nelle cellule erano statisticamente diversi rispetto al controllo positivo. Nei pre e post-trattamenti dei leucociti, l’estratto a tutte le concentrazioni tranne la più alta ha mostrato un effetto protettivo contro i danni al DNA indotti dall’H2O2, mostrando una significativa diminuzione dei danni totali al DNA rispetto al controllo positivo (Figura 2(b) (B, C)). Questi trattamenti hanno mostrato una correlazione dose-dipendente, con il più grande effetto protettivo ad una concentrazione di estratto di 0,312 mg mL-1 mentre la concentrazione di 20 mg mL-1 non ha mostrato alcuna protezione contro le comete indotte da H2O2.

L’assenza di un effetto genotossico oltre che antigenotossico significativo, cioè la riduzione del danno al DNA indotto da H2O2, sia nel pre che nel post trattamento, è stato notato anche per l’estratto del corpo fruttifero di T. gibbosa alle sette concentrazioni (Figura 2 (c)). Tuttavia, contrariamente agli estratti di T. hirsuta, una risposta dose-dipendente non è stata osservata negli estratti di basidiocarpo di T. gibbosa; vale a dire, una diminuzione graduale della concentrazione dell’estratto non corrispondeva a una riduzione proporzionale della genotossicità indotta da H2O2.

Gli estratti di micelio di T. versicolor, T. hirsuta, e T. gibbosa, a tutte le concentrazioni analizzate, non avevano attività genotossica (Figure 3(a) (A), 3(b) (A), e 3(c) (A)). Tutti gli estratti di micelio e le concentrazioni hanno mostrato un significativo effetto antigenotossico contro il danno al DNA indotto dall’H2O2, sia nel pre che nel post trattamento, e queste attività non erano marcatamente diverse. In T. versicolor, un’attività leggermente inferiore è stata notata alla concentrazione di estratto più bassa. In T. hirsuta, le concentrazioni di 5,0, 2,5, e 20,0 mg mL-1 erano più efficaci, mentre in T. gibbosa l’effetto protettivo maggiore è stato osservato ad una concentrazione di 2,5 mg mL-1 e il più basso a 20,0 mg mL-1 (Figure 3(a) (B, C), 3(b) (B, C), e 3(c) (B, C)).

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Figura 3

Effetto degli estratti di micelio di (a) Trametes versicolor, (b) T. hirsuta, e (c) T. gibbosa: (A) genotossico, (B) antigenotossico, pretrattamento, e (C) antigenotossico, posttrattamento. Tre esperimenti indipendenti con tre repliche per esperimento sono stati fatti e valutati dal test della cometa. Sono stati analizzati 100 nuclei per ogni replica. I dati rappresentano il numero totale di cellule con danni al DNA.

Numerosi composti mutageni e cancerogeni sono presenti in diverse fonti naturali. D’altra parte, alcuni composti naturali potrebbero essere sia pro-ossidanti che causano effetti genotossici e/o citotossici sia antiossidanti, a seconda della concentrazione e della durata dell’esposizione. Le specie di funghi altamente nutritive e medicinali possono avere diversi effetti in vitro e in vivo a causa della loro instabilità in condizioni di digestione o dell’incapacità di assorbimento da parte del tratto gastrointestinale. Cioè, le attività ottenute in vitro non corrispondono necessariamente a quelle trovate in vivo. È anche importante sottolineare che gli effetti genotossici e antigenotossici degli estratti di funghi dipendono dalla specie, dalla concentrazione e dal test utilizzato per la loro valutazione. Così, i nostri risultati hanno dimostrato diverse capacità delle tre specie di Trametes per diminuire i danni al DNA indotti dall’H2O2; per esempio, l’attività più bassa è stata notata nell’estratto del corpo fruttifero di T. hirsuta. Una chiara relazione dose-risposta inversa tra il livello di danno al DNA e la concentrazione dell’estratto è stata notata solo nell’estratto del basidiocarpo di T. hirsuta. Tuttavia, in T. versicolor e T. gibbosa, l’aumento della concentrazione dell’estratto al di sopra della dose ottimale non ha portato ad alcun miglioramento dei risultati della cometa, il che conferma i risultati di Miyaji et al. Questi autori hanno mostrato l’assenza di una relazione dose-risposta tra le concentrazioni di estratti di Lentinus edodes e il loro effetto antigenotossico. È importante menzionare che la combinazione di fenoli, flavonoidi e altri ingredienti negli estratti dovrebbe avere un potenziale maggiore rispetto ai singoli componenti degli estratti, indicando l’importanza delle coazioni di tutti gli ingredienti. Questo risultato potrebbe risultare in una diversa tendenza dell’attività antigenotossica di Trametes spp. La dipendenza dell’attività genotossica dell’estratto dal tipo di test è stata dimostrata da Morales et al. ; cioè, hanno riportato l’assenza di effetto mutageno degli estratti del basidiocarpo di Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus, e Pleurotus ostreatus sulle cellule di mammifero usando il test Ames Salmonella/microsoma. Tuttavia, una debole attività dell’estratto di P. ostreatus è stata ottenuta usando il test CHO/HPRT.

I meccanismi alla base dell’effetto antigenotossico degli estratti di funghi non sono ancora completamente conosciuti. Gli effetti protettivi degli estratti sembrano essere basati su più di un meccanismo d’azione, il che non è insolito per i funghi secondo Gebhart. I meccanismi di antigenotossicità potrebbero essere valutati con applicazioni di pre e post-trattamenti, cioè diverse combinazioni di estratti e H2O2. I nostri risultati positivi in entrambi i trattamenti indicano che gli estratti hanno effetti protettivi sia a livello di prevenzione che di intervento e possono agire come desmutageni e bioantimutageni, come dimostrato anche da studi precedenti. L’efficacia del pretrattamento, notato nel presente studio, potrebbe essere spiegato con l’aumento della capacità antiossidante delle cellule, cioè, stimolando la sintesi e l’attività degli enzimi antiossidanti durante l’induzione dello stress ossidativo. L’effetto positivo del post-trattamento potrebbe essere il risultato dell’azione sinergica delle attività di intervento attraverso lo scavenging dei radicali liberi e la stimolazione degli enzimi antiossidanti, così come l’eccitazione della riparazione del DNA, come suggerito da Chiaramonte et al. Poiché questi autori hanno riportato una significativa riparazione dei danni al DNA dopo 30-60 min di esposizione a un agente ossidativo, si potrebbe concludere che la riparazione del DNA ha giocato un ruolo meno significativo nella protezione contro l’H2O2 poiché le condizioni di post-trattamento hanno considerato fino a 30 min di incubazione. Pertanto, l’attività genoprotettiva degli estratti di Trametes spp. è probabilmente basata su azioni antiossidanti. D’altra parte, è noto che gli organismi eucarioti hanno evoluto una via di segnalazione, chiamata risposta al danno al DNA, per proteggersi dagli insulti genomici. Gasser e Raulet hanno dimostrato che la risposta al danno al DNA allerta il sistema immunitario inducendo l’espressione di ligandi della superficie cellulare per il recettore immunitario attivante NKG2D, che è espresso dalle cellule natural killer (cellule NK) e da alcune cellule T. Pertanto, l’attività genoprotettiva di Trametes spp. nelle cellule esposte ad agenti genotossici potrebbe modulare la risposta ai danni al DNA e funzionare come una barriera nella tumorigenesi iniziale. Le ulteriori ricerche dovrebbero includere l’analisi dei livelli di superossido dismutasi e catalasi nei linfociti trattati con estratti di Trametes spp. sia nel pre che nel post-trattamento con H2O2, al fine di confermare l’ipotesi che l’aumento della capacità antiossidante nelle cellule è indotto da questi estratti.

3.3. Attività antiossidante

Gli estratti etanolici testati erano buoni antiossidanti ma la loro attività dipendeva dalla specie. Gli estratti del corpo fruttifero hanno mostrato effetti di scavenging significativamente più alti rispetto agli estratti del micelio. La più alta attività di scavenging dei radicali DPPH è stata rilevata negli estratti di T. versicolor, sia del corpo fruttifero che del micelio (63,5% e 59,4%, rispettivamente) che è stata confermata dai valori EC50 (15,22 mg mL-1 e 16,18 mg mL-1, rispettivamente). Un livello di attività leggermente inferiore è stato trovato per gli estratti di T. hirsuta (59,0% per i basidiocarpi e 46,8% per il micelio), le cui concentrazioni di 17,06 mg mL-1 e 21,81 mg mL-1, rispettivamente, hanno fornito una riduzione del 50% dei radicali. T. gibbosa è stata la specie con il più basso potenziale di scavenging, specialmente degli estratti di micelio (39,7%) con un valore EC50 di 26,15 mg mL-1. Tuttavia, la capacità di scavenging dei radicali dell’estratto del corpo fruttifero non era significativamente inferiore rispetto alle altre due specie (53,7% e EC50 di 18,13 mg mL-1). L’attività di scavenging dell’antiossidante sintetico BHA era del 94,28%, e una concentrazione di 0,10 mg mL-1 forniva una riduzione del 50%.

Il contenuto totale di fenoli negli estratti di corpo fruttifero e di micelio delle specie Trametes era significativamente diverso () (Tabella 1). In generale, il contenuto di fenoli negli estratti del corpo fruttifero era superiore a quello degli estratti del micelio.

Sia gli estratti del basidiocarpo di T. versicolor che del micelio di T. versicolor erano i più ricchi di fenoli e flavonoidi, mentre le concentrazioni più basse sono state misurate negli estratti di T. gibbosa. Secondo le concentrazioni di fenoli e flavonoidi, gli estratti di T. hirsuta si trovavano tra gli estratti delle altre due specie (Tabella 1). Il grado di correlazione tra l’attività di scavenging degli estratti e il contenuto di fenoli e flavonoidi era alto con per i corpi fruttiferi di 0,98 e 0,99, rispettivamente, e per il micelio di 0,97 e 0,99, rispettivamente.

Studi precedenti hanno anche indicato il potenziale antiossidante delle specie Trametes. Così, Kamiyama et al. hanno dimostrato che una concentrazione di estratto di anche 0,5 mg mL-1 scavenged quasi il 50% di dipendere dal solvente, mentre Johnsy e Kaviyarasana notato riduzione di anche 91,5% dei radicali da un estratto di metanolo di T. gibbosa basidiocarps ad una concentrazione di 1,0 mg mL-1. Gli estratti etanolici testati nel nostro studio avevano capacità leggermente inferiori, ma superiori agli estratti etanolici del corpo fruttifero di T. hirsuta analizzati da Sheikh et al.

Secondo Mau et al. e Palacios et al. i composti fenolici svolgono un ruolo chiave nell’attività antiossidativa. Questi composti sono molto abbondanti e importanti costituenti dei corpi fruttiferi dei funghi e dei miceli. La loro capacità si basa sulla presenza di gruppi idrossilici che agiscono come agenti riducenti, chelanti di metalli, quenchers dell’ossigeno singoletto e donatori di idrogeno. Tuttavia, in alcuni casi la loro attività non potrebbe essere attribuita al contenuto totale di fenoli negli estratti, il che è confermato dal confronto dei nostri risultati con quelli di Johnsy e Kaviyarasana. Vale a dire, il 91,5% è stato ridotto dall’estratto del basidiocarpo di T. gibbosa contenente 23,8 μg GAE mg-1 estratto, mentre un estratto del ceppo BEOFB 310 con una concentrazione di fenoli di 20,07 μg GAE mg-1 estratto ha scavenged solo 63,5% radicali. Tuttavia, la concentrazione di flavonoidi nel ceppo serbo T. gibbosa era significativamente più alta rispetto al ceppo testato da Johnsy e Kaviyarasana (7,63 μg QE mg-1 di estratto e 0,59 μg QE mg-1 di estratto, rispettivamente), e questo potrebbe essere spiegato dalle diverse polarità dei solventi, nonché dalla diversa capacità del ceppo per la sintesi dei flavonoidi.

4. Conclusione

Lo studio è stato il primo tentativo di valutare l’attività protettiva del DNA degli estratti di T. versicolor, T. hirsuta, e T. gibbosa e determina se questo si basa sul loro potenziale antiossidante. I risultati suggeriscono che gli estratti di queste tre specie potrebbero essere considerati come forti agenti antigenotossici in grado di stimolare la risposta genoprotettiva delle cellule contribuendo a migliorare la funzione immunitaria, la rimozione delle tossine e il rafforzamento, che si riferisce all’uso tradizionale. Tuttavia, ulteriori indagini sono necessarie per rivelare i portatori specifici dell’attività antigenotossica e la modalità di protezione del DNA dai danni ossidativi.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi riguardo alla pubblicazione di questo articolo.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il Professor Dr. Steve Quarrie, Visiting Professor presso l’Università di Newcastle, Regno Unito, per la revisione e il miglioramento dell’inglese. Questo studio è stato condotto con il sostegno finanziario del Ministero dell’Istruzione, della Scienza e dello Sviluppo Tecnologico della Repubblica di Serbia, Progetto n. 173032 e Progetto n. 173034.