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DIAGNOSI DI DIFETTO DI ALFA-1-ANTITRISINA mediante analisi del DNA di bambini con malattia del fegato*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 e Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Background – Il deficit di Alfa-1-antitripsina è una malattia genetica che si trasmette in forma autosomica co-dominante. Il deficit di alfa-1-antitripsina colpisce principalmente i polmoni e il fegato portando, in quest’ultimo caso, a colestasi neonatale, epatite cronica o cirrosi. Una diagnosi precisa di deficit di Alfa-1-antitripsina può essere ottenuta tramite analisi biochimica o molecolare. Obiettivo – Lo scopo di questo studio è stato quello di utilizzare l’analisi del DNA per esaminare la presenza di un deficit di alfa-1-antitripsina in 12 bambini sospettati di avere questo deficit e che mostravano caratteristiche di laboratorio e cliniche della malattia. Pazienti e metodi – Sono stati studiati dodici pazienti, di età compresa tra 3 mesi e 19 anni, che avevano livelli sierici di alfa-1-antitripsina inferiori alla norma e/o avevano una malattia epatica di eziologia non definita. Gli alleli mutanti S e Z del gene dell’alfa-1-antitripsina sono stati studiati nei 12 bambini. L’organizzazione del gene alfa-1-antitripsina è stata analizzata mediante amplificazione del genoma attraverso la reazione a catena della polimerasi e la digestione con gli enzimi di restrizione Xmnl (allele S) e Taq 1 (allele Z). Risultati – Sette dei 12 pazienti avevano una malattia epatica cronica di eziologia indefinita e gli altri cinque pazienti avevano bassi livelli sierici di alfa-1-antitripsina e una diagnosi di colestasi neonatale e/o malattia epatica cronica di eziologia indefinita. Cinque dei 12 pazienti erano omozigoti per l’allele Z (ZZ) e due avevano l’allele S con un altro allele (*S) diverso da Z. Conclusione – Questi risultati mostrano che il deficit di alfa-1-antitripsina è relativamente frequente nei bambini con malattia epatica cronica di eziologia non definita e/o bassi livelli di alfa-1-antitripsina (41,6%). Una diagnosi corretta è importante per un efficace follow-up clinico e per la consulenza genetica.

Deficienza di alfa-1-antitripsina. Diagnosi molecolare. Biopsia epatica.

INTRODUZIONE

L’alfa-1-antitripsina (A1AT) è una glicoproteina di 52 kDa prodotta principalmente dagli epatociti che rilasciano 2 g di questa proteina al giorno nel sangue (36). La funzione principale dell’A1AT è di inibire l’azione dell’elastasi neutrofila, una serina proteasi che idrolizza le fibre di elastina nei polmoni(38). Le mutazioni nel gene che codifica per A1AT producono una proteina senza capacità inibitoria e possono portare all’accumulo di A1AT nei corpuscoli di inclusione negli epatociti, riducendo così i normali livelli sierici di questa proteina (4). Questa carenza si riflette come enfisema polmonare, bronchite cronica o bronchiectasie (9). L’accumulo di A1AT mutante negli epatociti può anche portare a colestasi neonatale, epatopatia cronica o cirrosi (33, 34).

Il gene A1AT è altamente polimorfo, co-dominante e si trova sul braccio più lungo del cromosoma 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Settantacinque alleli (designati A-Z secondo i loro punti isoeletrici) sono stati descritti per questo gene sulla base della focalizzazione isoelettrica del siero tra pH 4 (anodo) e pH 5 (catodo) in gel di poliacrilamide. Le varianti comuni migrano al centro del gel e quindi appartengono alla famiglia M (“middle”). Una variante carente, originariamente descritta da LAURELL e ERIKSSON nel 1963(21), migra verso il catodo ed è denominata Z. Un’altra variante, che si muove lentamente nel gel, è denominata S(5). Questo “locus” polimorfico è generalmente conosciuto come il sistema Pi (inibitore della proteasi). La maggior parte delle varianti produce A1AT in quantità e qualità normali (7, 8, 25). Tuttavia, alcuni alleli come le varianti S e Z sono associati a una condizione carente che raggiunge frequenze polimorfiche come le popolazioni caucasiche e sono stati riportati casi di un allele nullo in cui la produzione della proteina è totalmente assente(10).

L’allele S risulta dalla sostituzione dell’adenina con la tiamina nell’esone III del gene, che porta allo scambio dell’acido glutammico in posizione 264 con la valina e alla conseguente formazione di una struttura proteica instabile (10, 11, 19). L’allele Z risulta dalla sostituzione della guanina in posizione 342 con l’adenina nell’esone V del gene e porta alla formazione di una proteina che si raccoglie sulla superficie ruvida interna del reticolo endoplasmatico degli epatociti (6). La diagnosi di una condizione carente viene solitamente fatta dopo la quantificazione dei livelli sierici della proteina insieme al profilo elettroforetico dopo la focalizzazione isoelettrica(23, 37). Una diagnosi più precisa richiede un’analisi genica con tecniche basate sul DNA(12, 14, 26).

L’obiettivo di questo studio è stato quello di identificare i portatori degli alleli S e Z in pazienti sospettati di avere questo deficit e che mostravano caratteristiche di laboratorio e cliniche di questa malattia.

PATIENTI E METODI

Pazienti

Durante il periodo dal febbraio 1988 all’agosto 1997, un gran numero di pazienti è stato indirizzato al Servizio di Gastroenterologia Pediatrica dell’Università Statale di Campinas, Campinas, SP, Brasile, per studiare le malattie epatiche. Da questo numero solo 12 pazienti non hanno mostrato alcuna diagnosi definitiva (risultati negativi all’epatite virale, all’epatite autoimmune e alla malattia di Wilson). Questi pazienti sono stati sottoposti a un’analisi molecolare di A1AT.

Metodi

1 ¾ Protocollo di studio

2 – Biopsia epatica

Le biopsie epatiche sono state ottenute come descritto dal MOWAT(24) in anestesia locale in pazienti a digiuno da almeno 4 ore, con venoclisi e attività protrombinica normale. Il frammento ottenuto è stato immediatamente posto in formalina al 10% e poi lavorato e colorato con ematossilina-eosina, tricromica di Masson, blu di Prussia e impregnazione con argento delle fibre del reticolo. Una colorazione speciale è stata ottenuta con PAS (acido periodico-Schiff) seguita da un trattamento con diastasi. La persistenza di granuli citoplasmatici dall’aspetto eosinofilo anche dopo l’uso della diastasi è stata considerata positiva per il deficit di A1AT.

3 – Analisi molecolare

Per studiare gli alleli mutanti S e Z dell’A1AT, è stata fatta un’estrazione di DNA da leucociti di sangue periferico come nel metodo descritto da WOODHEAD et al.(39).

RISULTATI

Cinque dei 12 bambini studiati erano omozigoti Z (ZZ) mentre due dei bambini avevano l’allele S insieme ad un altro allele che non era Z (*S). La tabella 1 mostra l’età del paziente al momento del prelievo di sangue e l’indicazione usata per decidere le successive analisi. Tre dei pazienti hanno presentato una colestasi neonatale come manifestazione iniziale dell’epatopatia cronica.

Tabella 2 mostra i livelli sierici di ALT, AP, gGT, A1AT così come i risultati dello studio molecolare e della biopsia epatica.

I cinque pazienti con il genotipo ZZ avevano ridotti livelli sierici di A1AT e la biopsia epatica mostrava cirrosi (uno), epatite neonatale (due), una pochezza dei dotti biliari interlobulari (uno) ed epatite cronica (uno). In quest’ultimo caso (FSP), granuli citoplasmatici dall’aspetto eosinofilo sono stati visti in epatociti periportali in seguito a colorazione con HE e confermati posteriormente da positività PAS e resistenza alla diastasi (Figura 1). I due pazienti con colestasi neonatale (EKBA e RHBP) sono stati sottoposti a biopsia epatica quando avevano rispettivamente 10 e 13 settimane, e hanno mostrato globuli eosinofili PAS-positivi e resistenti alla diastasi.

Le figure 2 e 3 mostrano i risultati dell’amplificazione e della digestione degli alleli S e Z, rispettivamente.

DISCUSSIONE

Il deficit di alfa-1-antitripsina è uno dei più comuni disordini genetici che porta alla malattia epatica nei bambini ed è la più comune malattia genetica che richiede il trapianto di fegato(17, 28). Il deficit di A1AT colpisce 1 neonato su 1600-2000 nel Nord America e nel Nord Europa(28, 31), ma solo il 10-15% della popolazione con questo deficit sviluppa malattie epatiche(32, 33). Secondo uno studio pubblicato da SVEGER nel 1988(33), durante il periodo neonatale l’11% dei pazienti con il fenotipo PIZZ sviluppa un’epatite itterica. In questo studio, tre pazienti con diagnosi di deficit di A1AT avevano colestasi neonatale e in due di questi, prima che fosse stabilita una diagnosi definitiva del deficit, la colestasi era considerata idiopatica. Il 5-10% dei casi di epatite neonatale idiopatica riportati in letteratura sono causati da un deficit di A1AT (3).

In cinque pazienti con questo deficit studiati, i livelli sierici di A1AT erano inferiori al limite inferiore normale. Tuttavia, questo test non ha assolutamente confermato la diagnosi della malattia. Poiché A1AT è una proteina della fase infiammatoria acuta, la sua sintesi aumenta in condizioni infiammatorie/infettive, neoplasie, gravidanza e durante la terapia con estrogeni e corticosteroidi (16, 22). Una riduzione dei livelli sierici di A1AT si verifica nella sindrome di angoscia respiratoria dei neonati, nella fase terminale dell’insufficienza epatica, nella fibrosi cistica e nelle situazioni in cui c’è una grande perdita di proteine (15). I livelli sierici nei genotipi SZ, che potrebbero teoricamente provocare malattie epatiche, sono di solito normali.

Quando la colestasi neonatale è presente, è fondamentalmente necessaria una diagnosi differenziale con l’atresia biliare extraepatica. La storia clinica permette una diagnosi adeguata nell’83% dei casi (1) e sono necessarie indagini specifiche per migliorare la precisione della diagnosi. Tra queste indagini, la biopsia epatica è di grande importanza. Le alterazioni istopatologiche osservate nella biopsia epatica dei pazienti con deficit di A1AT possono essere le stesse di quelle osservate nell’epatite neonatale idiopatica o nei casi di atresia biliare extraepatica (24). La presenza di globuli prevalentemente periportali e intraepatocistici che sono fortemente positivi alla PAS dopo la digestione della diastasi è un’indicazione utile del deficit di A1AT (13, 18, 27). Tuttavia, è difficile identificare questi globuli prima della 12a settimana dopo la nascita (35). In questo studio, il paziente EKBA aveva globuli con le caratteristiche di cui sopra nel tessuto epatico all’età di 10 settimane. Nessun globulo di questo tipo è stato visto nel paziente JCI (13 settimane). Questi risultati suggeriscono che la presenza di globuli dovrebbe essere indagata utilizzando una colorazione speciale in frammenti epatici ottenuti prima delle 12 settimane di età, anche se un risultato negativo non elimina la possibilità di carenza di A1AT. L’analisi biochimica non è stata utilizzata in questo studio poiché era possibile l’analisi del DNA, che è più precisa.

Un deficit di A1AT è relativamente frequente nei bambini che hanno una malattia epatica di eziologia non definita. Questa diagnosi è sottostimata, probabilmente perché vengono utilizzati metodi diagnostici imprecisi. L’analisi molecolare fornisce una diagnosi più precisa e può anche essere utile per la consulenza genetica dei pazienti con malattia epatica di eziologia sconosciuta.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina è una malattia genetica trasmessa in forma autossômica co-dominante. Le manifestazioni cliniche principali comprendono l’acometismo polmonare ed epatico. Questo ultimo, si presenta come colestasi neonatale, epatite critica o cirrosi. La diagnosi definitiva viene fatta tramite l’analisi biochimica dell’alfa-1-antitripsina o l’analisi molecolare. Objetivo – Investire, in un gruppo di 12 bambini con sospetta deficienza di alfa-1-antitripsina, la presenza efetiva della deficienza attraverso l’analisi del DNA, per una diagnosi definitiva, così come l’associazione tra i deficit di alfa-1-antitripsina e le caratteristiche cliniche e di laboratorio riscontrate. Casistica e metodi – Gli alleli mutanti S e Z del gene dell’alfa-1-antitripsina sono stati studiati in 12 pazienti di età compresa tra 3 mesi e 19 anni, riferito dall’ambulatorio di gastroenterologia pediatrica della Universidade Estadual de Campinas, SP, Brasile, per la presentazione di livelli sierici di alfa-1-antitripsina inferiori al normale e/o malattia epatica senza eziologia definita. L’analisi del DNA è stata eseguita utilizzando il metodo di amplificazione genica della reazione a catena della polimerasi modificato che crea siti di restrizione per gli enzimi Xmnl (allele S) e Taq l (allele Z). Risultati – Dei 12 pazienti inviati, 7 avevano una malattia epatica cronica senza eziologia definita e gli altri 5 avevano bassi dosaggi sierici di alfa-1-antitripsina accompagnati da una diagnosi di colestasi neonatale e/o malattia epatica cronica di eziologia sconosciuta. In questo gruppo di 12 pazienti, cinque pazienti omozigoti Z (ZZ) sono stati osservati e due hanno portato l’allele S accompagnato da un altro allele, diverso da Z (*S). Conclusione – Questi risultati mostrano che la carenza di A1AT è un’eziologia relativamente frequente nei bambini che presentano una malattia epatica cronica senza eziologia definita e/o un basso dosaggio di A1AT nel siero (41,6%). L’importanza di una diagnosi di certezza per il deficit è giustificata non solo per il follow-up clinico del paziente ma anche, in termini di consulenza genetica.

DESCRITORI ¾ Carenza di alfa-1-antitripsina. Diagnosi molecolare. Biopsia del fegato.

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Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Studio condotto dai Dipartimenti di Pediatria, Genetica Medica, Patologia Anatomica e Patologia Clinica della Facoltà di Scienze Mediche (FCM), Università Statale di Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brasile.

1 Studente post-laurea. Dipartimento di Pediatria, FCM/UNICAMP.

2 Professore assistente. Dipartimento di Patologia Clinica, FCM/UNICAMP.

3 Professore assistente. Dipartimento di Patologia Anatomica, FCM/UNICAMP.

4 Dottorato in Genetica (Istituto di Biologia), UNICAMP.

5 Professore assistente. Dipartimento di genetica medica, FCM/UNICAMP.

6 Professore assistente. Dipartimento di Pediatria, FCM/UNICAMP.