Come impostare il tuo esperimento di eluizione

Cosa hanno in comune le mini preparazioni di DNA e gli esperimenti di immunoprecipitazione delle proteine? Iniziano in modo diverso, ma finiscono con la stessa fase critica: l’eluizione. Ma cos’è esattamente l’eluizione, e qual è il punto?

La terminologia

Primo, iniziamo con un po’ di terminologia di base:

Eluzione – estrazione di un materiale da un altro mediante lavaggio con un solvente.

L’adsorbente – una fase solida, che può essere un gel di silice nel caso delle colonne mini-prep, ma di solito perline che possono essere legate covalentemente ad anticorpi o altre molecole ligandi. “Fase solida” non significa necessariamente una colonna permanente; può essere perline in una eppendorf che sono facili da lavare.

Affinità – una misura della capacità dell’assorbente di legare la molecola di scelta (ciò che si sta cercando di eluire). Più alta è l’affinità della fase solida alla biomolecola di scelta (BOC), più stretta è la molecola che vi si lega. Tuttavia, non vuoi che il legame sia irreversibile; questo renderà l’eluizione impossibile.

Eluente – un solvente che rimuove il BOC dall’assorbente.

Eluato – il solvente contenente il BOC rimosso dall’adsorbente.

Preparazione del materiale

Prima dell’eluizione, devi assorbire la molecola di scelta mentre ti liberi della contaminazione. Questo è un passo essenziale, come la saggezza convenzionale ci ricorda “garbage in, garbage out”. Puoi avere ottimi reagenti per l’eluizione, ma se il tuo campione contiene troppo personale non correlato (il termine scientifico è “gunk”), intaserà il materiale di adsorbimento. La saturazione della fase solida impedirà al vostro BOC di assorbire e quindi contaminare l’eluato. Le fasi di lisi e pulizia efficaci sono essenziali per il successo del vostro esperimento di eluizione.

È importante determinare il volume del vostro materiale di pre-assorbimento. Il volume di lisato che passa attraverso il mezzo di assorbimento non dovrebbe superare i 3 – 5 volumi della colonna. Il grande volume di lisato che passa attraverso l’assorbente aumenta il tempo dell’esperimento, così come la probabilità di assorbimento del gunk. In molti casi, vale la pena di ridurre il volume iniziale di lisato per filtrazione o frazionamento. Così, il volume del lisato determina la dimensione della colonna.

La scelta del materiale di adsorbimento dipende dalla composizione chimica della vostra molecola di interesse. L’assorbimento delle biomolecole di solito comporta un’interazione più o meno specifica tra il substrato e la molecola. Per esempio, il DNA viene assorbito sulle mini-colonne a causa dell’interazione ionica tra i gruppi fosfato del DNA caricati negativamente e le particelle di silice caricate positivamente.

Le proteine vengono solitamente adsorbite su sefarosio o su perline magnetiche ricoperte di IgG.

Dopo una prima applicazione di lisato, in nessun punto la vostra colonna può asciugarsi. Questo “cuocerà la vostra” molecola all’assorbente e interromperà l’integrità della colonna. Se non hai tempo per continuare l’esperimento, rabbocca la colonna con un tampone compatibile e ferma il flusso.

Lavaggio

Lo scopo del lavaggio della fase solida è di rimuovere un materiale non correlato, lasciando la molecola di interesse sulla colonna. La separazione selettiva è spesso ottenuta utilizzando un tampone a bassa forza ionica (ad esempio, bassa concentrazione di sale). Il volume del tampone di lavaggio dovrebbe essere vicino alla quantità di materiale iniziale ed essere almeno 3-5 volumi della colonna.

Tuttavia, dopo diversi volumi di tampone di lavaggio passati attraverso la colonna, le contaminazioni saranno lavate via e qualsiasi lavaggio aggiuntivo non migliorerà la qualità della vostra preparazione. Inoltre, inizierai a perdere il tuo materiale target.

Eluzione

Immagine: Cromatogramma che mostra il profilo di assorbimento UV del surnatante di Arabidopsis separato su Sephadex G-50 Superfine. Volume del gel: 500 mL; lunghezza della colonna: 700 mm; diametro della colonna: 30 mm; velocità di flusso dell’eluente: 12 mL / ora; volume della frazione: 8,0 mL; numero di frazioni: 95; volume del campione: 5 mL; temperatura di separazione: 4 ° C; buffer di eluizione: 20 mM Tris-HCl, 1 mM NaN3; pH 8.0. Image credit: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chrom_SephG-50.tif

L’eluizione stessa funziona perché si interrompono i legami tra la colonna e il substrato (cioè usando un sale elevato o un’alta temperatura dell’eluente). L’eluizione è di solito fatta in un piccolo volume di tampone compatibile con la conservazione del campione e con ulteriori applicazioni.

L’eluizione del DNA dalla colonna mini-prep è il caso più semplice: un volume di tampone rimuove quasi tutto il DNA. La concentrazione di DNA nell’eluato è inversamente proporzionale al tampone di eluizione usato: più tampone si usa, minore è la concentrazione finale di DNA. Tuttavia, anche in questo caso, la maggior parte dei produttori raccomanda di utilizzare un volume aggiuntivo per rimuovere tutto il DNA.

Per le colonne, la velocità di eluizione è critica. Una velocità troppo lenta aumenterà le possibilità di degradazione della molecola; troppo veloce e non ci sarà risoluzione delle frazioni.

Per le colonne di grande volume, è necessario raccogliere frazioni di eluato perché la vostra molecola sarà distribuita tra loro. La prima frazione conterrà un mix di buffer di lavaggio ed eluizione e possibili contaminazioni non rimosse dal buffer di lavaggio.

Puoi monitorare la OD per il tuo tipo di molecola (260nm/280nm per il DNA) e fare un blot per la concentrazione della tua specifica molecola in ogni frazione. Nel caso più semplice, la distribuzione della tua molecola seguirà una semplice curva a campana, ma può avere uno o più picchi netti.

In conclusione, conoscere i parametri di base del tuo esperimento (assorbente, dimensione della colonna, tampone di lavaggio, tampone di eluizione, velocità di flusso, numero di frazioni) e i principi generali di eluizione ti permetterà di impostare la tua eluizione con successo.

Per maggiori dettagli, trova un articolo dove gli altri scienziati hanno fatto qualcosa di simile – idealmente la stessa molecola, ma una simile andrà bene – e adattala alle tue condizioni.