Clonazione molecolare con la reazione a catena della polimerasi, una guida educativa per l’ingegneria cellulare

Scegliere gli enzimi di restrizione adeguati in base a criteri definiti

Per procedere con un esempio conciso, la proteina fluorescente tdTomato è stata clonata in un vettore alpharetroviral. Conseguentemente, è stata generata una linea cellulare di leucemia murina che esprime tdTomato. Questa linea cellulare sarà usata per tracciare le cellule tumorali dopo l’iniezione nei topi in studi preclinici di immunoterapia. Tuttavia, questo metodo di clonazione è applicabile a qualsiasi altro gene. Per iniziare il progetto di clonazione, il gene di interesse (GOI) deve essere analizzato. In primo luogo, controlliamo se la nostra sequenza annotata ha un codone iniziale (ATG, il codone iniziale più comune) e uno dei tre codoni di stop (TAA, TAG, TGA). Nel caso in cui il gene sia stato precedentemente manipolato o fuso con un altro gene (ad esempio tramite una sequenza 2A), succede che un gene di interesse potrebbe non avere un codone di stop. In questi casi, un codone di stop deve essere aggiunto alla fine della vostra sequenza annotata. E’ anche utile investigare se il tuo GOI contiene un open reading frame (ORF). Questo è importante perché la frequente manipolazione delle sequenze sia tramite software che tramite clonazione potrebbe erroneamente aggiungere o eliminare nucleotidi. Usiamo il software Clone Manager (SciEd) per trovare ORF nelle nostre sequenze di plasmide; tuttavia, ci sono diversi siti web gratuiti che è possibile utilizzare per trovare ORF tra cui il NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).

Il gene tdTomato contiene ATG inizio codone e TAA stop codone (Figura 1). La dimensione del gene tdTomato è di 716 bp.

Panoramica dell’inizio e della fine del gene di interesse. (A) Le sequenze nucleotidiche all’inizio e alla fine del gene tdTomato sono mostrate. I nucleotidi del filamento codificante sono specificati in grassetto (B) Sono mostrate le sequenze nucleotidiche dei primer forward e reverse contenenti i siti appropriati dell’enzima di restrizione e la sequenza Kozak.

In una fase successiva, devono essere progettati primer PCR che includono siti appropriati dell’enzima di restrizione per l’amplificazione del GOI. Diversi criteri dovrebbero essere considerati per scegliere gli enzimi di restrizione ottimali. In primo luogo, i siti di legame per gli enzimi di restrizione dovrebbero essere idealmente disponibili in un sito di clonazione multipla all’interno del vettore. In alternativa possono essere situati a valle del promotore nella sequenza del vettore. Gli enzimi di restrizione dovrebbero essere tagliatori singoli (tagliatori singoli bersaglio un solo sito di restrizione all’interno di una sequenza di DNA) (Figura 2A). Se sono doppi o multipli, dovrebbero tagliare all’interno di una sequenza che non è necessaria per il corretto funzionamento del plasmide vettore e saranno infine rimossi (Figura 2B). È anche possibile scegliere un enzimi a taglio doppio o multiplo che tagliano il vettore a valle del promotore e anche non all’interno di una sequenza vitale del plasmide (Figura 2C). Gli enzimi tagliatori doppi o multipli hanno due o più siti di restrizione su una sequenza di DNA, rispettivamente. Tagliando il vettore con cutter doppi o multipli si otterrebbero due estremità identiche. In tal caso, la cassetta dell’inserto dovrebbe anche contenere gli stessi siti dell’enzima di restrizione su entrambe le sue estremità. Pertanto, quando i frammenti dell’inserto e del vettore vengono mescolati in un esperimento di legatura, l’inserto può fondersi con il vettore sia nel giusto orientamento (dal codone di inizio al codone di stop) che inversamente (dal codone di stop al codone di inizio). Un terzo scenario può verificarsi, se il frammento del vettore forma un cerchio auto-legante omettendo del tutto l’inserto. Una volta che il DNA è stato incubato con gli enzimi di restrizione, la defosforilazione delle estremità 5′ e 3′ del plasmide vettore utilizzando un enzima fosfatasi alcalina ridurrà notevolmente il rischio di auto-legatura. E’ quindi importante vagliare un prodotto di clonazione per questi tre prodotti (orientamento giusto, orientamento inverso, auto-legatura) dopo la legatura del frammento.

Scegliere gli enzimi di restrizione adeguati in base a criteri definiti per il clonaggio PCR. (A) Due enzimi di restrizione a taglio singolo (E1 ed E2) sono situati a valle del promotore. (B) Gli enzimi di restrizione E1 ed E2 tagliano il plasmide a valle del promotore diverse volte (qui due volte per ogni enzima). (C) L’enzima di restrizione E1 taglia il plasmide a valle del promotore più di una volta. (D) Il prodotto PCR, che contiene il gene tdTomato e i siti dell’enzima di restrizione, è stato eseguito su un gel prima di essere estratto per le applicazioni a valle.

In secondo luogo, a causa della maggiore efficienza di clonazione utilizzando frammenti di DNA con estremità appiccicose, è auspicabile che almeno uno (meglio entrambi) degli enzimi di restrizione sia un cosiddetto “sticky-end cutter”. I tagliatori di estremità appiccicose tagliano il DNA in modo asimmetrico generando estremità coesive complementari. Al contrario, i tagliatori di estremità smussate tagliano la sequenza simmetricamente senza lasciare sporgenze. Clonare frammenti di estremità smussate è più difficile. Tuttavia, scegliere un rapporto molare inserto/vettore più alto (5 o più) e l’uso del 10% di polietilenglicole (PEG) può migliorare la legatura dei frammenti blunt-end.

In terzo luogo, alcuni enzimi di restrizione non tagliano il DNA metilato. La maggior parte dei ceppi di E. coli contengono metilasi Dam o Dcm che metilano le sequenze di DNA. Questo li rende resistenti agli enzimi di restrizione sensibili alla metilazione. Dal momento che il DNA vettore viene preparato per lo più in E. coli, sarà metilato. Quindi evitare gli enzimi di restrizione sensibili alla metilazione è auspicabile; tuttavia, a volte l’isoschizomero di un enzima di restrizione sensibile alla metilazione è resistente alla metilazione. Per esempio, l’enzima Acc65I è sensibile mentre il suo isoschizomero kpnI è resistente alla metilazione. Gli isoschizomeri sono enzimi di restrizione che riconoscono le stesse sequenze nucleotidiche. Se non rimane altra opzione che usare enzimi di restrizione sensibili alla metilazione, il DNA vettore deve essere preparato in ceppi di E. coli dam – dcm -. Un elenco di questi ceppi e anche comuni ceppi ospiti E. coli per il clonaggio molecolare è riassunto nella tabella 1. Le informazioni riguardanti la sensibilità alla metilazione degli enzimi di restrizione sono solitamente fornite dal produttore.

In quarto luogo, rende il clonaggio più facile se il buffer necessario per la piena funzionalità degli enzimi di restrizione è lo stesso perché si può eseguire una doppia digestione di restrizione. Questo fa risparmiare tempo e riduce la perdita di DNA durante la purificazione. Può succedere che uno degli enzimi di restrizione sia attivo in un buffer e che il secondo enzima sia attivo in una concentrazione doppia dello stesso buffer. Per esempio l’enzima NheI di Thermo Scientific è attivo nel tampone Tango 1X (Thermo Scientific) e l’enzima EcoR1 è attivo nel tampone Tango 2X (Thermo Scientific). In questi casi, il DNA plasmidico deve essere prima digerito dall’enzima che richiede la concentrazione maggiore del tampone (in questo caso EcoR1). Questo sarà seguito dalla diluizione del buffer per l’enzima successivo (che richiede una concentrazione inferiore (qui NheI)) nello stesso buffer. Tuttavia, l’emergere di tamponi universali ha semplificato la doppia digestione delle sequenze di DNA. Nel nostro esempio il vettore contiene i siti di restrizione AgeI e SalI. Questi siti enzimatici sono stati usati per progettare i primer della PCR (Figura 1). È essenziale per una corretta digestione dell’enzima di restrizione che la purezza del plasmide sia elevata. L’assorbanza del DNA misurata da uno spettrofotometro può essere usata per determinare la purezza dopo la purificazione. Il DNA, le proteine e i solventi assorbono rispettivamente a 260 nm, 280 nm e 230 nm. Un rapporto OD 260/280 di >1,8 e un rapporto OD 260/230 di 2 a 2,2 è considerato puro per i campioni di DNA. I rapporti OD 260/280 e 260/230 delle nostre preparazioni plasmidiche esemplari erano 1,89 e 2,22, rispettivamente. Abbiamo osservato che la purezza del vettore gel-estratto e frammenti di DNA inserto erano più bassi dopo digestione di restrizione; legatura funziona anche in tali casi, tuttavia, migliori risultati possono essere attesi utilizzando frammenti ad alta purezza.

Il seguente sito web di deposito di plasmidi può essere utile per la selezione di diversi vettori (espressione virale e imballaggio, backbone vuoti, proteine fluorescenti, vettori inducibili, epitope tag, proteine di fusione, geni reporter, sistemi di espressione specie-specifici, marcatori di selezione, promotori, espressione shRNA e ingegneria del genoma):http://www.addgene.org/browse/.

Una collezione di vettori di clonazione di E. coli è disponibile al seguente sito web:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.

Progettazione di primer di clonazione basati su criteri definiti

Per la progettazione di primer PCR, controlla i codoni di inizio e fine del tuo GOI. Trovate la sequenza degli enzimi di restrizione desiderati (disponibili sui siti web dei produttori) per il primer forward (Figura 3A). Deve essere situato prima del GOI (Figura 1B). La cosiddetta sequenza Kozak si trova negli mRNA eucariotici e migliora l’inizio della traduzione. È vantaggioso aggiungere la sequenza Kozak (GCCACC) prima del codone di inizio ATG poiché aumenta la traduzione e l’espressione della proteina di interesse negli eucarioti. Pertanto, abbiamo inserito GCCACC immediatamente dopo la sequenza dell’enzima di restrizione AgeI e prima del codone di inizio ATG. Poi, i primi 18-30 nucleotidi del GOI a partire dal codone di inizio ATG sono aggiunti alla sequenza del primer forward. Questi nucleotidi sovrapposti che si legano al DNA modello determinano la temperatura di annealing (Tm). Quest’ultima è solitamente superiore a 60°C. Qui, usiamo la DNA polimerasi ad alta fedeltà Phusion (Thermo Scientific). Puoi usare i seguenti siti web per determinare la Tm ottimale:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.

Progettazione di primer basati su criteri definiti per il clonaggio PCR. (A-B) Le sequenze dei primer forward e reverse sono rappresentate. L’estremità del filamento codificante deve essere convertita nel formato del complemento inverso per la progettazione del primer inverso. Per ulteriori informazioni, si prega di consultare il testo.

https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.

Il Tm del nostro primer forward è 66°C.

Scegliete gli ultimi 18-30 nucleotidi incluso il codone di stop del vostro GOI per progettare il primer reverse (Figura 3B). Poi calcolate la Tm di questa sequenza che dovrebbe essere superiore a 60°C e vicina alla Tm del primer forward. Il Tm della sequenza sovrapposta del nostro primer inverso era di 68°C. Poi, aggiungere la sequenza target del secondo sito dell’enzima di restrizione (in questo caso SalI) immediatamente dopo il codone di stop. Infine, convertire questa sequenza assemblata in una sequenza a completamento inverso. I seguenti siti web possono essere utilizzati per determinare la sequenza del primer inverso:

http://reverse-complement.com/

http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis è importante poiché il primer inverso si lega al filamento codificante e quindi la sua sequenza (5′ → 3′) deve essere inversamente complementare alla sequenza del filamento codificante (Figura 1A).

Eseguire la PCR usando polimerasi proofreading

Siccome la reazione di PCR segue un’amplificazione logaritmica della sequenza bersaglio, qualsiasi errore di replicazione durante questo processo sarà amplificato. Il tasso di errore delle DNA polimerasi non proofreading, come la Taq polimerasi, è di circa 8 × 10-6 errori/bp/ciclo PCR; tuttavia, gli enzimi proofreading come la Phusion polimerasi hanno un tasso di errore riportato di 4,4 × 10-7 errori/bp/ciclo PCR. A causa della sua fedeltà e processività superiore, la polimerasi Phusion DNA è stato utilizzato in questo esempio. Va notato che Phusion ha diversi requisiti di temperatura rispetto ad altre DNA polimerasi. La Tm del primer per Phusion è calcolata in base al metodo di Breslauer ed è più alta della Tm utilizzando le polimerasi Taq o pfu. Per avere risultati ottimali, il Tm dovrebbe essere calcolato in base alle informazioni trovate sul sito web dei fornitori dell’enzima. Inoltre, a causa della maggiore velocità di Phusion, da 15 a 30 secondi sono solitamente sufficienti per l’amplificazione di ogni kb della sequenza di interesse.

Dopo la PCR, il prodotto deve essere caricato su un gel (Figura 2D). La banda corrispondente deve essere tagliata e il DNA estratto. È essenziale sequenziare il prodotto della PCR poiché il prodotto della PCR potrebbe includere mutazioni. Ci sono diversi kit di clonazione PCR disponibili alcuni dei quali sono riportati nella tabella 2. Abbiamo usato il vettore di clonazione pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, pubblicazione del brevetto: US 2009/0042249 A1, numero di adesione Genbank EF694056.1) e clonato il prodotto di PCR nel vettore linearizzato. Questo vettore contiene un gene letale (eco47IR) che viene attivato nel caso in cui il vettore si circolarizzi. Tuttavia, se il prodotto PCR viene clonato nel sito di clonazione all’interno del gene letale, quest’ultimo viene interrotto permettendo ai batteri di crescere colonie dopo la trasformazione. I vettori circolarizzati che non contengono il prodotto PCR esprimono il gene tossico, che quindi uccide i batteri precludendo la formazione di colonie. I cloni batterici devono poi essere coltivati, il DNA plasmidico isolato consecutivamente e sequenziato. La qualità del plasmide isolato è essenziale per ottenere risultati ottimali di sequenziamento. Abbiamo isolato il DNA plasmidico da un totale di 1,5 ml di batteri coltivati (resa 6 μg di DNA; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) utilizzando un kit di preparazione del plasmide mini (QIAGEN). L’intero processo di PCR, compresa la clonazione del prodotto PCR nel vettore di sequenziamento e la trasfezione dei batteri con il vettore di sequenziamento può essere fatto in un giorno. Il giorno successivo, i cloni batterici saranno coltivati durante la notte prima di essere inviati per il sequenziamento.

Analisi dei dati di sequenziamento

Le aziende di sequenziamento normalmente riportano i dati di sequenziamento come file FASTA e anche come sequenze di nucleotidi pronti via e-mail. Per l’analisi delle sequenze, possono essere utilizzati i seguenti siti web:

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi

Qui ci concentreremo sul primo sito. Nella pagina di questo sito, cliccate sull’opzione “nucleotide blast” (Figura 4A). Si apre una nuova finestra. Per default, l’opzione “blastn” (blast nucleotide sequences) è marcata (Figura 4B). Poi spuntate la casella dietro “Allinea due o più sequenze”. Ora appariranno due caselle. Nella casella “Enter Query Sequence” (la casella superiore), inserite la sequenza desiderata del vostro gene di interesse, che è affiancata dai siti di restrizione che avete già progettato per i vostri primer PCR. Nella casella “Enter Subject Sequence” (la casella inferiore), inserisci la sequenza o carica il file FASTA che hai ricevuto dalla società di sequenziamento. Poi clicca sul pulsante “BLAST” in fondo alla pagina. Dopo un paio di secondi, i risultati saranno mostrati su un’altra pagina. Una parte dei dati di allineamento è mostrata nella Figura 4C. Per l’interpretazione, dovrebbero essere considerati i seguenti punti: 1) il numero di nucleotidi identici (indicato alla voce “Identità”) deve essere uguale al numero di nucleotidi del vostro gene di interesse. Nel nostro esempio, il numero di nucleotidi del gene tdTomato insieme a quelli dei siti dell’enzima di restrizione e della sequenza Kozak era 735. Questo è uguale al numero riportato (Figura 4C). 2) L’identità di sequenza (alla voce “Identità”) dovrebbe essere del 100%. Occasionalmente, l’identità di sequenza è del 100% ma il numero di nucleotidi identici è inferiore al previsto. Questo può accadere se uno o più nucleotidi iniziali sono assenti. Ricorda che tutte le tecnologie di sequenziamento hanno un tasso di errore. Per il sequenziamento Sanger, questo tasso di errore è riportato per variare da 0,001% a 1%. La sostituzione nucleotidica, la delezione o l’inserimento possono essere identificati analizzando i risultati del sequenziamento. Pertanto, se l’identità di sequenza non raggiunge il 100%, il plasmide dovrebbe essere risequenziato per differenziare gli errori della PCR dai semplici errori di sequenziamento. 3) Le lacune (alla voce “Gaps”) non dovrebbero essere presenti. Se si verificano lacune, il plasmide deve essere risequenziato.

Analisi della sequenza del prodotto della PCR usando la piattaforma NCBI BLAST. (A) Sulla pagina web di NCBI BLAST, è stata scelta l’opzione “nucleotide blast” (contrassegnata dalla linea ovale). (B) L’opzione “blastn” appare per default (segnata dal cerchio). La sequenza del gene di interesse (affiancata dai siti di restrizione come precedentemente progettato per i primer di PCR) e il prodotto di PCR devono essere inseriti nelle caselle “Enter Query Sequence” e “Enter Subject Sequence”. Le sequenze possono anche essere caricate come file FASTA. (C) Viene mostrato l’allineamento nucleotidico dei primi 60 nucleotidi. Due elementi importanti per l’analisi della sequenza sono contrassegnati da linee ovali.

La lunghezza media di una lettura, o read length, è di almeno 800-900 nucleotidi per il sequenziamento Sanger. Per il vettore pJET un primer forward e uno reverse devono essere usati per il sequenziamento del gene completo. Questi primer possono normalmente coprire una dimensione del gene che va fino a 1800 bp. Se la dimensione di un gene è più grande di 1800, un primer extra dovrebbe essere progettato per ogni 800 nucleotidi extra. Dal momento che la chiamata affidabile della base non inizia immediatamente dopo il primer, ma circa 45-55 nucleotidi a valle del primer, il successivo primer forward dovrebbe essere progettato per iniziare dopo circa 700 nucleotidi dall’inizio del gene. Diversi siti web, tra cui i seguenti, possono essere utilizzati per progettare questi primer:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design

Essendo 735 bp di lunghezza, la dimensione del prodotto PCR in questo esempio era ben all’interno della gamma dei primer di sequenziamento pJET.

Dopo aver scelto il clone con sequenza verificata, i plasmidi vettore e inserto sono stati digeriti dagli enzimi di restrizione AgeI e SalI (Figura 5). Questo è stato seguito dalla purificazione del gel e dalla legatura dei frammenti. La trasformazione di E. coli competente con la miscela di legatura ha prodotto diversi cloni che sono stati esaminati dagli enzimi di restrizione. Abbiamo valutato otto cloni, tutti contenenti l’inserto tdTomato (Figura 6). È importante scegliere cloni che siano grandi. I cloni satellite potrebbero non avere il costrutto giusto. Abbiamo usato un kit veloce di mini-preparazione del plasmide (Zymo Research) per estrarre il plasmide da 0,6 ml di sospensione batterica. La resa e la purezza erano soddisfacenti per lo screening basato sugli enzimi di restrizione (2,3 μg di DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). Per la purificazione del plasmide su larga scala, è stato utilizzato un kit di maxi-preparazione (QIAGEN) per estrarre il plasmide da 450 ml di coltura batterica (resa 787 μg di DNA; OD 260/280 = 1.89; OD 260/230 = 2.22). La resa prevista di un isolamento del plasmide pBR322-derivato da 1,5 ml e 500 ml di coltura batterica è di circa 2-5 μg e 500-4000 μg di DNA, rispettivamente.

Vettore e inserire mappe plasmide A) Illustrazione del plasmide CloneJET contenente il prodotto PCR. L’inserimento del prodotto di PCR nel sito di clonazione del plasmide interrompe l’integrità del gene tossico eco47IR e permette la crescita di cloni positivi al transgene. Il plasmide è stato tagliato con gli enzimi AgeI e SalI generando due frammenti di 3 kb e 0,7 kb di dimensione. Il frammento da 0,7 kb (gene tdTomato) è stato usato come inserto per il clonaggio. (B) Illustrazione del plasmide vettore. Il plasmide è stato tagliato con gli enzimi AgeI e SalI generando due frammenti di 4,9 kb e 0,7 kb di dimensione. Il frammento da 4,9 kb è stato usato come vettore per il clonaggio. AMP: Ampicillin resistance gene; PRE: posttranscriptional regulatory element; MPSV: myeloproliferative sarcoma virus promoter.

Screening del plasmide finale con enzimi di restrizione. Viene mostrata l’illustrazione del plasmide finale. Per lo screening, il plasmide è stato tagliato con l’enzima BsiwI generando due frammenti di 4,8 kb e 0,8 kb di dimensione. AMP: Ampicillin resistance gene; PRE: posttranscriptional regulatory element; MPSV: myeloproliferative sarcoma virus promoter.

Alcuni plasmidi tendono a ricombinarsi all’interno dell’ospite batterico creando inserzioni, delezioni e ricombinazioni. In questi casi, può essere utile usare un E. coli con deficit di recA (Tabella 1). Inoltre, se il GOI è tossico, l’incubazione dei batteri a temperature più basse (25-30°C) e l’utilizzo di ceppi ABLE C o ABLE K potrebbero aggirare il problema.

Produzione virale e trasduzione di cellule bersaglio

Per studiare l’espressione in vitro del gene clonato, le cellule HEK293T sono state trasfettate con plasmidi che codificano il gene tdTomato, alpharetroviral Gag/Pol, e l’involucro della glicoproteina del virus della stomatite vescicolare (VSVG). Queste cellule, che sono derivate dal rene embrionale umano, sono facilmente coltivate e facilmente trasfettate. Perciò sono ampiamente utilizzate nella biotecnologia e nella terapia genica per generare particelle virali. Le cellule HEK293T richiedono di essere divise ogni due giorni usando un terreno caldo. Non dovrebbero raggiungere il 100% di confluenza per ottenere risultati ottimali. Per avere una buona efficienza di trasfezione, queste cellule devono essere coltivate per almeno una settimana per averle in fase log. Efficienza di trasfezione era 22%, come determinato in base all’espressione di tdTomato da microscopia a fluorescenza 24 ore dopo (Figura 7A-B). Per generare una linea cellulare di leucemia murina che esprime il gene tdTomato per studi di immunoterapia, C1498 cellule leucemiche sono state trasdotte con il virus appena raccolto (36 ore di trasfezione). Gli studi di imaging (Figura 7C) e l’analisi citometrica a flusso (Figura 7D) quattro giorni dopo la trasduzione hanno confermato l’espressione di tdTomato nella maggior parte delle cellule.

Valutazione dell’espressione in vitro del gene clonato. (A, B) Le cellule HEK293T sono state trasfettate con i plasmidi Gag/Pol, VSVG e tdTomato. L’espressione del gene tdTomato è stata valutata usando un microscopio a fluorescenza. Le immagini fluorescenti sono state sovrapposte a un’immagine in campo chiaro per la differenziazione delle cellule trasdotte positivamente. L’efficienza della trasfezione è stata determinata in base all’espressione di tdTomato dopo 24 ore. Le cellule HEK293T non trasfezionate sono state usate come controlli (istogramma blu). (C, D) La linea cellulare di leucemia murina C1498 è stata trasdotta con virus fresco. Quattro giorni dopo, l’espressione del transgene è stata valutata mediante microscopia a fluorescenza (C) e citometria a flusso (D). Le cellule C1498 non trasdotte sono state usate come controlli (istogramma blu). Le barre della scala rappresentano 30 μm.