A Comparison of Immunohistochemistry and Western Blot

By Sarah Moore, M.Sc.Reviewed by Michael Greenwood, M.Sc.

Immunohistochemistry and Western blotting both work by exploiting the principle of how antibodies specifically bind to the antigens present in biological tissue.

Image Credit: Sinitar/.com

L’immunoistochimica è la più comune delle tecniche di immunostaining. Visualizza la presenza di antigeni mirati all’interno di un campione di tessuto utilizzando anticorpi che si attaccano agli antigeni, avendo un effetto catalitico, e scindendo la molecola in composti identificabili. La visualizzazione di questa interazione può essere ottenuta utilizzando un enzima (producendo un segnale cromogenico) o un fluoroforo (creando un segnale fluorescente).

Il western blot funziona sullo stesso principio. È stato segnalato per la prima volta negli anni ’70, quando gli scienziati l’hanno usato per classificare con successo le diverse proteine presenti nei tessuti biologici. Da allora, sono stati fatti progressi significativi nella tecnologia, che hanno portato alla creazione della moderna tecnica Western blot fluorescente, colorimetrica e chemiluminescente.

Tutte le versioni del metodo Western blot si basano sul funzionamento del complesso antigene-anticorpo per identificare proteine specifiche presenti in un campione, indicate dalle reazioni enzima-substrato di molecole colorimetriche, chemiluminescenti o fluorescenti. La luce prodotta da queste fonti può essere usata per dedurre la presenza e la concentrazione delle proteine in un campione.

Confronto delle tecniche

Mentre i due metodi si basano sul principio dell’interazione anticorpo-antigene, ci sono alcune differenze importanti tra le due tecniche. Qui di seguito, le analizziamo passo dopo passo.

In primo luogo, per entrambe le tecniche, il campione deve essere preparato correttamente. La preparazione differisce abbastanza significativamente tra le due. Per l’immunoistochimica, i campioni di tessuto vengono affettati o lasciati interi, a seconda delle loro dimensioni.

Il limite per le dimensioni dei campioni varia generalmente da 3 µm a 5 µm. Successivamente, i campioni sono incorporati in un mezzo, di solito cera di paraffina o criomedia. In seguito, le fette sono poste su vetrini e disidratate con lavaggi alcolici di forza crescente, terminando infine con l’aggiunta di un detergente per pulire il campione, rendendolo pronto per essere visto al microscopio.

D’altra parte, il Western blot richiede che i campioni siano prima separati per elettroforesi e poi immobilizzati in una membrana di blotting.

Il metodo di colorazione del campione è anche leggermente diverso tra le due tecniche. L’immunoistochimica aggiunge anticorpi policlonali o monoclonali. Questi anticorpi sono classificati come reagenti primari o secondari, i primi sono quelli sollevati contro un antigene bersaglio e sono solitamente non coniugati, i secondi sono coniugati a una molecola di collegamento che poi recluta le molecole reporter.

La versione coniugata è usata in un metodo di colorazione diretta, dove l’anticorpo reagisce direttamente con l’antigene nel campione, la versione non coniugata è usata in un metodo di colorazione indiretta dove l’anticorpo non marcato si lega all’antigene target all’interno del tessuto, facendo reagire un anticorpo secondario con l’anticorpo primario.

In confronto, il metodo Western blot vede un colorante fluorescente aggiunto al campione, seguito dall’esposizione a una fonte di luce della lunghezza d’onda appropriata per eccitare le molecole dei fluorofori.

Dopo un certo tempo, i fluorofori eccitati alla fine rilasciano l’energia che hanno guadagnato dalla fonte di luce per tornare al loro stato fondamentale. Questo rilascio di energia è ciò che rende i fluorofori fluorescenti, emettendo una fonte di luce che può essere catturata da un imager digitale.

Confronto dei vantaggi e degli svantaggi

Il principale vantaggio dell’immunoistochimica è che il metodo permette ai ricercatori di rilevare l’esatta posizione di una proteina target all’interno di un campione di tessuto. Questo vantaggio principale l’ha portata ad affermarsi nel campo delle neuroscienze come un metodo robusto per indagare l’espressione delle proteine in posizioni cerebrali bersaglio.

D’altra parte, il metodo ha un grande svantaggio rispetto al metodo Western blot. Questo è il fatto che le macchie non sono controllate contro una scala di peso molecolare, come nel Western blot, il che significa che non c’è modo di provare che la colorazione mostrata nell’immunoistochimica è definitivamente legata a una proteina specifica.

Il metodo indiretto dell’immunoistochimica è riconosciuto per essere altamente sensibile, tuttavia, il metodo diretto è noto per essere il contrario, ed è generalmente incapace di rilevare piccole concentrazioni di antigeni bersaglio.

Il metodo Western blot è vantaggioso in quanto si è affermato come una tecnica affidabile per raccogliere dati quantitativi. Tuttavia, il suo vantaggio più importante è che ha dimostrato di essere efficace nel generare un segnale che è proporzionale alla quantità della proteina che esiste nel campione.

Inoltre, il Western blot è spesso scelto per la sua capacità di rilevare numerose proteine bersaglio simultaneamente, avendo l’effetto di ridurre significativamente il tempo di analisi così come il numero di risorse necessarie.

Una differenza nelle applicazioni

C’è una grande quantità di sovrapposizione nelle applicazioni delle due tecniche, dato che sono così simili. Tuttavia, nel complesso, l’immunoistochimica è per lo più utilizzata come strumento diagnostico per numerosi tumori.

Il metodo è utilizzato per identificare le cellule anormali che sono caratteristiche di alcuni tumori. Il metodo è anche ampiamente utilizzato per identificare e localizzare le proteine e i biomarcatori che si trovano sia nei tessuti normali che in quelli malati. Infine, è anche comunemente utilizzato per individuare numerosi organismi infettivi all’interno dei tessuti.

In confronto, il Western blot è principalmente utilizzato per l’individuazione di malattie autoimmuni, allergie e malattie infettive. È ampiamente utilizzato nei campi della biologia molecolare, biochimica e biologia cellulare, con le sue applicazioni più notevoli utilizzate come strumento diagnostico per l’HIV e la BSE.

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Scritto da

Sarah Moore

Dopo aver studiato Psicologia e poi Neuroscienze, Sarah ha trovato rapidamente il suo piacere per la ricerca e la scrittura di documenti di ricerca; trasformandosi in una passione per collegare idee con persone attraverso la scrittura.

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