Trp53 null és R270H mutáns allélok hasonló hatással vannak az invázió, metasztázis és génexpresszió szabályozására egér vastagbél tumorigenezisben

Missense és null Trp53 mutációk elősegítik az egér vastagbéldaganatok progresszióját CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK) egerekben. a CDX2P-CreERT2AK (AK) egerek (n = 10, medián túlélés = 336 nap), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) egerek (n = 16, medián túlélés = 166 nap) Kaplan-Meier túlélési görbéi, CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) egerek (n = 16, medián túlélés = 97 nap) és CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) egerek (n = 20, medián túlélés = 88 nap). A TAM-ot két napon keresztül naponta adtuk, és a nulladik időpont e napok közül a másodikat jelenti. A P-értékeket log-rank teszttel kaptuk a következő összehasonlításokban: P = 1,4E-6 AK vs. AKP270/+; P = 1,4E-7 AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1,9E-8 AKP270/fl vs. AKP270/+. b Az AK egerek, AKP270/+ egerek, AKPfl/fl egerek és AKP270/fl egerek különböző mélységű invázióval rendelkező vastagbéldaganatainak százalékos aránya. Az adatok egérenként több lézióból származnak (n = 10-14 egér csoportonként). A Fisher Exact teszteken és az Exact Poisson-teszteken alapuló P-értékeket az 1. táblázat, illetve az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. A hibasávok az átlag standard hibáját jelentik. A adenoma, SM submucosa, MP muscularis propria, SS subserosa, S serosa. c, d Hematoxilin és eozin (H&E) festés a proximális vastagbél (jobbra) és a cecum (balra) szövetekből származó reprezentatív invazív tumorokról AKP270/fl egerek (c) és AKPfl/fl egerek (d) esetében. A (c) és (d) ábrázolt tumorokat 3 hónappal a TAM injekció beadása után gyűjtöttük. A nagy nagyítású képek az alsó panelekben láthatók, és a megfelelő felső panelekben az alacsonyabb nagyítású területek be vannak keretezve. A szaggatott vonalak jelzik az izomréteg és a subserosa közötti határt. Méretsávok: 500 μm az alacsony nagyítású képen (felső panelek); 100 μm a nagy nagyítású képekhez (alsó panelek)

A p53 mutáns egerekből származó vastagbél adenokarcinómák hisztológiai típusai. H&E festések (bal oldali panelek) és immunhisztokémiai festések a β-kateninre (középső panelek) és a p53-ra (jobb oldali panelek) az AKP270/fl egerek (a) és az AKPfl/fl egerek (b) reprezentatív szövettani típusainak független vastagbéldaganatain láthatóak. A tumorokat 3 hónappal a TAM indukció után gyűjtöttük be. Méretsávok: A boncoláskor 13 AKPfl/fl egérből 3-ban és 14 AKP270/fl egérből 5-ben találtak nyirokcsomó-metasztázisokat (2. táblázat). A három AKPfl/fl egér közül, amelyek mindegyikénél volt metasztázis egy hasi nyirokcsomóban, egy egérnél többszörös metasztázisok voltak a tüdőben, egy másik egérnél pedig többszörös metasztázisok a májban (2. táblázat). Az öt AKP270/fl egér közül, amelyek mindegyikénél volt egy-egy metasztázis egy hasi nyirokcsomóban, egy egérnél többszörös metasztázisok voltak a tüdőben, egy másik egérnél pedig mind a tüdőben, mind a májban metasztatikus elváltozások voltak (2. táblázat). Az AK vagy AKP270/+ egerekben nem találtak áttétes elváltozást (2. táblázat). Adataink azt mutatják, hogy a Trp53 miszense vagy null mutációival rendelkező egér CRC-k hasonló gyakorisággal adhatnak spontán nyirokcsomó- és távoli metasztázisokat, ami a miszense Trp53 mutációk GOF hatása ellen szól a metasztázis fokozásában egér CRC modellünkben.

Epithelial-mesenchymal transition in metastatic CRCs with missense or null Trp53

Az öt különböző AKP270/fl egér mindegyikében talált egyedi nyirokcsomó-metasztatikus lerakódásokban, négy elváltozás mérsékelten differenciált adenokarcinómát mutatott, egy elváltozás pedig gyengén differenciált volt (ábra. 3a, b, felső panelek). A mérsékelten differenciált nyirokcsomó-metasztatikus léziók mindegyikében erős nukleáris β-katenin festődés, valamint erős E-kadherin membránfestődés és hiányzó vimentin festődés volt (3a. ábra), ami az epiteliális tulajdonságok megtartására utal a mérsékelten differenciált tulajdonságokat megőrző AKP270/fl metasztatikus sejtekben. Abban az egy AKP270/fl egérben, ahol a nyirokcsomó-metasztázis gyengén differenciált tulajdonságokkal rendelkezett, a tüdőben, a májban és a cecumban is találtak gyengén differenciált morfológiájú adenokarcinóma elváltozásokat (3b. ábra és 1. kiegészítő ábra). A rosszul differenciált cecumlézió és az áttétes elváltozások erős nukleáris β-katenin festődést és az E-kadherin expressziójának elvesztését, valamint erős vimentin expressziót mutattak, ami összhangban volt az epiteliális-mesenchimális átmenet (EMT) jellemzőivel (3b. ábra és 1. kiegészítő ábra). Az AKP270/fl egerek összes metasztatikus léziója pozitívan festődött CDX2-re (2. kiegészítő ábra), ami összhangban van a vastagbél epiteliális eredetével.

A miszense Trp53 mutációkkal rendelkező vastagbélből származó metasztatikus tumorok epiteliális-mesenchimális átmenetnek (EMT) vethetők alá. Két reprezentatív AKP270/fl egérben talált nyirokcsomó- és tüdőmetasztázisokat bemutató H&E-festésű metszetek fotomikroszkópos felvételei (a, b, felső panelek). Immunhisztokémiai festések, amelyek a β-katenin erős nukleáris expresszióját, az E-kadherin erős membrán expresszióját és a vimentin expressziójának hiányát mutatják az egyik reprezentatív egérben talált mérsékelten differenciált elváltozások esetében (a, alsó három panel). Ezzel szemben egy másik egérben talált gyengén differenciált elváltozások (b) a β-katenin erős nukleáris expresszióját, az E-kadherin expressziójának elvesztését és a vimentin erős expresszióját mutatják, ami arra utal, hogy az ebben az egérben talált metasztatikus elváltozások EMT-n mentek keresztül (b, alsó három panel). A H&E-festésű metszetek reprezentatív fotómikroszkópos felvételeit a tájékozódás érdekében kis erősítésű nagyítással mutattuk be; a sorozatmetszeteket immunhisztokémiai festésnek vetettük alá, és a β-katenin, E-kadherin és vimentin festődését tartalmazó dobozos területet nagy erősítésű nagyítással ábrázoltuk. Méretsávok: 20 μm minden kép esetében

A tumoros AKPfl/fl egerekből származó három nyirokcsomó-metasztázis közül kettő mérsékelten differenciált, egy pedig gyengén differenciált volt (4a, b ábra, felső panelek). A májmetasztázissal rendelkező AKPfl/fl egérnek mérsékelten differenciált nyirokcsomó-metasztázisa volt. Ebben a májmetasztázisos egérben a feltételezett index vastagbél primer adenokarcinóma, valamint a nyirokcsomó- és májmetasztatikus elváltozások mindegyike a β-katenin erős nukleáris expresszióját és az E-kadherin erős membrán expresszióját mutatta (3. kiegészítő ábra). A rosszul differenciált nyirokcsomó-metasztázissal rendelkező egyetlen AKPfl/fl egérben a tüdőben is több hasonló morfológiájú elváltozást találtak (4b. ábra). Immunhisztokémiai vizsgálatok azt mutatták, hogy a tüdőmetasztatikus léziók és a cecumban lévő feltételezett index primer adenokarcinóma mindegyike a β-katenin erős nukleáris expresszióját és csökkent E-kadherin expresszióját, valamint erős vimentin expresszióját mutatta, ami összhangban van az EMT-vel az elsődleges rákban és a metasztatikus sejtekben (4b. ábra). Az AKPfl/fl egerek metasztatikus léziói mind CDX2-pozitívak voltak (4. kiegészítő ábra). Összességében adataink azt mutatják, hogy nincs jelentős különbség az AKP270/fl egerekben és az AKPfl/fl egerekben kialakuló metasztatikus elváltozások szövettani jellemzői között, és az elsődleges tumorok és metasztatikus elváltozások rosszul differenciált, miszense vagy null Trp53 mutációkkal rendelkező alcsoportja EMT jellemzőket mutathat.

A null Trp53-mutációval rendelkező metasztatikus tumorok epiteliális-mesenchimális átmenetet (EMT) mutathatnak. a H&E-festésű metszet fotomikroszkópos felvétele, amely egy reprezentatív AKPfl/fl egér nyirokcsomójában talált mérsékelten differenciált tumorléziót mutat 2,5 hónappal a TAM-injekció után (felső panel). Ennek az elváltozásnak az immunhisztokémiai festése a β-katenin erős nukleáris expresszióját, az E-kadherin erős membrán expresszióját és a vimentin expressziójának hiányát mutatja (alsó három panel). b H&E-festésű metszetek fotomikroszkópiái, amelyek egy másik AKPfl/fl egér 4 hónappal a TAM-injekciót követően a cecumban, a nyirokcsomóban és a tüdőben talált gyengén differenciált elváltozásokat mutatják (felső panel). Mindezek az elváltozások a β-katenin erős nukleáris expresszióját, az E-kadherin expressziójának elvesztését és a vimentin erős expresszióját mutatják, ami azt jelzi, hogy az ebben az egérben talált primer és metasztatikus elváltozások EMT-n mentek keresztül (alsó három panel). A H&E-festésű metszetek reprezentatív fotómikroszkópos felvételeit a tájékozódás érdekében kis erősítésű nagyítással mutattuk be; a sorozatmetszeteket immunhisztokémiai festésnek vetettük alá, és a β-katenin, E-kadherin és vimentin festődését tartalmazó dobozos területet nagy erősítésű nagyítással ábrázoltuk. Méretsávok: 20 μm az összes képen

A miszense mutáns p53 fehérje stabilizációja a vad típusú p53 elvesztésével és a betegség progressziójával jár

A miszense TP53 mutációkkal rendelkező humán tumorok többségénél TP53 heterozigozitásvesztést (LOH) mutattak ki , és egy tanulmány szerint a TP53 LOH előfeltétele a miszense mutáns p53 stabilizációjának egérszarkómákban és emlőrákokban egyaránt . AKP270/+ egerekben a tumorigenezis TAM-injekcióval történő indukcióját követően a tumorfejlődés különböző stádiumaiban értékeltük a p53 festődési mintázatát, mivel az AKP270/+ egerekben a Cre-célzott vastagbél epitélium kezdetben egy funkcionális Trp53 alléllal rendelkezik. Az AKP270/+ egerek hiperplasztikus polipjaiban, ahol a Kras aktiválódik és az Apc LOH még nem következett be, a p53 festődés nem kimutatható (5b. ábra, HP panel), hasonlóan a vad típusú egerek epitéliumában megfigyelhető negatív p53 festődéshez (5a. ábra), annak ellenére, hogy a p53 R270H miszenz mutáns fehérje konstitucionálisan kifejeződik az AKP270/+ egerek vastagbélszöveteiben. Az AKP270/+ egerekben keletkező adenomákban (5b. ábra, panel adenoma és 3. táblázat, n = 185) és karcinómákban (5c. ábra és 3. táblázat, n = 28) egyértelműen látható volt némi p53 immunreaktivitás. E daganatok közül az adenomák 94%-a és a karcinómák 43%-a gyenge p53-festődést mutatott (5. ábra és 3. táblázat, 5-10% pozitivitás), míg az adenomák 6%-a és a karcinómák 57%-a erős p53-festődést mutatott (5. ábra és 3. táblázat, >10% pozitivitás, P < 0,0001). Az erős p53-festődésű tumorok többsége p53 LOH-t mutatott, míg a gyenge p53-festődésű tumorok továbbra is megtartották a Trp53 vad típusú allélját (6. ábra). Eredményeink hasonlóak az egérszarkómákban és emlőkarcinómákban a p53 miszense fehérje expressziójával kapcsolatos közelmúltbeli munkákban tapasztaltakhoz . Adataink azt mutatják, hogy a humán vastagbél tumorigenezisben kialakult helyzethez hasonlóan a stabilizált miszense mutáns p53 fehérje kifejeződése szorosan összefügg a vad típusú p53 funkció elvesztésével és az invázió progressziójával.

A p53R270H mutáns fehérje stabilizálódása a tumorprogresszió során a hyperplasiától a karcinómáig AKP270/+ egerekben. A p53 immunhisztokémiai festése egy reprezentatív hyperplasztikus polipban (HP, b, bal panel), egy adenomában (b, jobb panel) és három AKP270/+ egerek cecumában keletkezett karcinómában (c). Kontrollként egy vad típusú egér cecumából származó metszetet használtunk (a). A p53 festődés a normális (a) és HP (b) metszetekben a nem kimutatható festődéstől a gyenge festődésig (<10% pozitivitás) az adenómában (b) és az 1-es karcinómában (c, bal panel), valamint az erős festődésig a 2-es és 3-as karcinómában (>10% pozitivitás) terjed. A szaggatott vonalak a muscularis mucosae-t jelzik. Fekete nyilak jelzik a gyenge p53 festődésű invazív mirigyeket; piros nyilak jelzik az erős p53 festődésű invazív mirigyeket. Méretsávok: Ábrák: 50 μm

A p53R270H miszenzmutáns stabilizációja korrelál a p53 heterozigótia-veszteséggel (LOH). a AKP270/+ egerekben 5 hónappal a TAM indukció után keletkező vastagbéldaganatok (T2-T6) genotipizálása 5 hónappal. Pozitív és negatív kontrollként egy AKP270/fl egérből származó daganatot (T1) és egy vad típusú egérből származó vastagbélszövetet (N) használtunk. A Trp53 vad típusú allél és a rekombinált Trp53 mutáns allél (flox out) jelenlétét PCR segítségével mutattuk ki. b-e A p53 immunhisztokémiai festése az (a) pontban leírt vastagbélszövetekben erős korrelációt mutat a mutáns p53 stabilizációja (d, T2 és T3) és a p53 heterozigóta veszteség között, szemben a gyenge p53 festéssel és a Trp53 vad típusú allél jelenlétével a tumorokban 4-6 (e). A szaggatott vonalak a muscularis mucosae-t jelölik. Méretsávok: 100 μm

A globális génexpressziós profilalkotás kevés különbséget mutat az R270H/R273H miszenzmutáns és null Trp53/TP53 allélokat hordozó egér vagy humán vastagbéldaganatok között

Az AKP270/fl (n = 6) vagy AKPfl/fl (n = 6) egerekből származó vastagbél adenokarcinóma szövetekben Affymetrix Mouse ST 2 segítségével génexpressziós profilokat készítettünk.1 Arrays 24 562 szondakészlettel. RNS-t izoláltunk a rákos sejtek lézerfogásos mikrodissectióját (LCM) követően minden egér egy-egy invazív primer tumorából. Kontrollként vad típusú egerekből (n = 3) származó, mikrodissezált normál vastagbél epitélsejteket vontunk be. ANOVA-modelleket illesztettünk erre a 15 mintára, 3 átlagra vonatkozó feltételekkel. A tumorszövetek és a normál szövetek összehasonlítása több mint 2400 szondakészletet adott P < 0,001 értékkel mind az AKP270/fl, mind az AKPfl/fl tumorok esetében, de a két tumortípus egymással való összehasonlítása csak 30 szondakészletet adott, ahol pusztán véletlenszerűen 24,6 szondakészletet (24 562*0,001) vártunk. Ez utóbbi eredmény azt jelzi, hogy a talált 30 szondakészlet nagy része hamis pozitív eredmény (4. táblázat, felső rész), és a Trp53 miszense mutációval rendelkező és a Trp53 null mutációval rendelkező vastagbéldaganatok között kevés, vagy egyáltalán nem volt szignifikáns megfigyelhető különbség a génexpresszióban. Ezzel az elképzeléssel összhangban azt találtuk, hogy az AKP270/fl és az AKPfl/fl adenokarcinómák nem voltak megkülönböztethetők a génexpresszió főkomponens (PC) elemzésében, bár mindkét tumorcsoport génexpressziós mintázata egyértelműen különbözik a vad típusú vastagbélhámtól (Kiegészítő ábra. 5).

Az AKP270/fl egerekben (n = 3) vagy AKPfl/fl egerekben (n = 2) keletkezett vastagbéldaganatokból származó organoidokon is végeztünk Affymetrix génexpressziós elemzést. Kontrollként Apcfl/fl egerek adenomáiból (Cont 1, n = 3) vagy vad típusú vastagbélhámból (Cont 2, n = 4) származó organoidokat használtunk. ANOVA-modellt illesztettünk a négy organoidcsoportra. Az AKPfl/fl organoidok esetében 435 szondakészletet találtunk P < 0,001 értékkel, az AKP270/fl organoidok esetében pedig 609 szondakészletet az Apc-null organoidokhoz képest (Cont 1, 4. táblázat). Ezenkívül több differenciálisan expresszálódó szondakészletet azonosítottak (960 az AKPfl/fl és 1332 az AKP270/fl esetében, P < 0,001), amikor az AKPfl/fl vagy AKP270/fl organoidokat a normál vastagbél organoidokhoz hasonlították (Cont2, 4. táblázat). Útvonal-gazdagítási tesztet végeztünk az AKPfl/fl és AKP270/fl tumorokban és organoidokban differenciálisan expresszálódó géneken a normál vastagbél epitélhez képest. Azt találtuk, hogy számos útvonal jelentősen megváltozott mind a p53 null és miszense mutáns tumorból származó sejtekben, a G2M-checkpointban, a sejtnövekedésben, a stresszválaszban és a sejtanyagcserében szerepet játszó gének voltak a leginkább jelentősen megváltozott génkészletek (2. kiegészítő táblázat). Ugyanakkor az AKPfl/fl vs. AKP270/fl összehasonlításban csak 35 olyan szondakészletet kaptunk, amelyeknél a P < 0,001 volt (4. táblázat), ahol ismét 24,6 volt véletlenszerűen várható, ami azt mutatja, hogy a null és miszense Trp53 mutációval rendelkező organoidok között nehéz volt génexpressziós különbségeket találni. A PC-plotok azt mutatták, hogy az AKPfl/fl és AKP270/fl minták mindig együtt klasztereződtek, és elkülönültek az Apc-mutáns adenomákból (Cont1, 6. kiegészítő ábra) vagy normál vastagbélhámból (Cont2, 6. kiegészítő ábra) származó organoidoktól.

Azért, hogy megvizsgáljuk, vannak-e kimutatható különbségek a génexpressziós mintázatokban a miszense és null TP53 mutációval rendelkező humán CRC-k között, elemeztük a The Cancer Genome Atlas (TCGA) CRC-k RNS-seq adataiból származó log2-transzformált normalizált számokat , összehasonlítva 9 TP53 kodon 273 missense mutációval rendelkező tumort 36 nullmutációval rendelkező (frame shift, splice site és nonsense mutációk által okozott, lásd a 3. kiegészítő táblázat részleteit) tumorral, kétmintás T-próbával 20531 génre vonatkozóan. Mindössze 244 gént találtunk P < 0,01 és 30 gént P < 0,001 értékkel, ami alig több, mint a véletlen által várt szám (205, illetve 20,5, 4. táblázat). Maga a TP53 adta a legjelentősebb különbséget a génexpresszióban, amely átlagosan majdnem ötször alacsonyabb volt a nullmutációval rendelkező tumorokban a TP53 kodon 273 mutációjával szemben (4. kiegészítő táblázat, P = 2 × 10-10). A PC-analízis során ismét csak kevés elkülönülést találtunk a két tumorcsoport között (7. kiegészítő ábra). A hasonló transzkripciós szignatúrával összhangban 43 beteg túlélési adataira Cox-proporcionális veszélyességi modelleket illesztettünk, a modellben az életkor, a stádium és a TP53-státusz felhasználásával, és nem találtunk szignifikáns összefüggést a betegek kimenetele és a TP53-mutációs státusz között (R273 miszense mutáció vs. nullmutáció, Kiegészítő 5. táblázat, P = 0,67 Wald-teszttel). Érdemes megemlíteni, hogy mivel e betegek között csak 7 haláleset volt, a különbségek kimutatásának ereje meglehetősen alacsony volt. Végül megnéztük azon gének metszetét, amelyek P < 0,05 értéket adtak a fent leírt három adatsor bármelyikében (azaz humán és egér vastagbéldaganatok, egér vastagbélorganoidok), és amelyek a Trp53/TP53 miszense vs. null mutáció összehasonlításban azonos irányban változtak. A 4. kiegészítő táblázatban azokat a géneket mutatjuk be, amelyek P < 0,05 és legalább 1,3-as fold-változást adtak a három adatsor bármelyikében. Csak olyan Trp53/TP53-t találtunk, amely mindhárom vizsgálatban azonos irányban változott (4. kiegészítő táblázat; az egyes gének részletes statisztikája mindhárom adatkészletben elérhető a nyilvános GEO-sorozatunkban). Összességében az egér és humán CRC-k génexpressziós elemzéseink azt mutatják, hogy az R270/R273 missense vagy null Trp53/TP53 mutációkkal rendelkező vastagbéldaganatok nagyon hasonló génexpressziós profillal rendelkeznek, ami összhangban van azzal, hogy az AKP270/fl és AKPfl/fl egerekben nincsenek jelentős különbségek a vastagbéldaganatok biológiai jellemzőiben és az in vivo kialakuló fenotípusokban.