Radiometrikus ligandum-kötési próbák | Application Support Knowledgebase | Lab Products & Services | PerkinElmer

top

Overview

A radioaktív ligandumokat általában a receptorokhoz való ligandumkötés mérésére használják. Ebben a vizsgálatban egy radioaktívan jelölt ligandum kötődését fogja mérni az érdeklődésre számot tartó receptort tartalmazó sejtekhez vagy sejtmembránokhoz. Egész sejtek és sejtmembránok egyaránt használhatók ehhez a vizsgálathoz. A radioligandok felhasználhatók telítési görbék, kompetíciós és kinetikai kísérletek elvégzésére.

Ligand-receptor kötődés

A radioligand kiválasztásakor néhány tényezőt figyelembe kell venni:

• Magas specifikus aktivitás: A magas specifikus aktivitású radioligandok jól alkalmazhatók ligandumkötési vizsgálatokhoz. A specifikus aktivitás azt jelzi, hogy a ligandum egy molekulájára mennyi radioaktivitás jut, és általában a ligandum millimoljára vonatkoztatott Curie-egységben adják meg. Számos 125I-jelölt ligandumunkat maximális fajlagos aktivitással kínáljuk (2200 Ci/mmol, ha egy 125I-jelölőhely áll rendelkezésre, 4400 Ci/mmol, ha két 125I-jelölőhely áll rendelkezésre stb.) Ez azt jelzi, hogy gyakorlatilag a raktári fiolában található ligandum minden molekulája sugárzással van jelölve. A tritiált ligandumok (3H ligandumok) esetében ideális esetben olyan ligandumot kell választani, amelynek fajlagos aktivitása 20 Ci/mmol felett van. A maximális elméleti specifikus aktivitás tríciumra vetítve 29 Ci/mmol (Curie per millimol trícium). Az ezen érték feletti specifikus aktivitás azt jelzi, hogy átlagosan minden ligandummolekula legalább egy tríciummal rendelkezik.
• Alacsony nem specifikus kötődés: A hidrofób ligandumok általában magasabb nem specifikus kötődést mutatnak. Ez néha kompenzálható a szűrők BSA-val való bevonásával a nem-specifikus kötődés csökkentése érdekében. A BSA, sók vagy detergensek hozzáadása a mosó- vagy kötőpufferhez szintén segíthet a nem-specifikus kötődés csökkentésében. Ha a radiokémiai készletet szilanizált fiolába csomagolták (lásd a műszaki adatlapot), ez azt jelezheti, hogy a ligandum kissé hidrofób
• Nagy tisztaságú: Ideális esetben a ligandumnak 90% feletti radiokémiai tisztaságúnak kell lennie. A radiokémiai tisztaság idővel csökken, és ennek a lebomlásnak a tényleges sebessége idővel felgyorsul. A különböző radiokémiai vegyületeink radiokémiai tisztasága és lebomlási sebessége megtalálható a tétel-specifikus műszaki adatlapokon.
• Nagy szelektivitás: Minél szelektívebb a ligandum az Ön receptorához, annál jobbak lesznek az adatai. A magas szelektivitás azt jelzi, hogy a ligandumot többnyire csak egyetlen érdekes receptor fogja felismerni, szemben a sejtmembránban esetleg jelenlévő más receptorokkal. Továbbá, ha olyan membránokat használunk, amelyek túlexprimálják az érdeklődésre számot tartó receptort, csökkenthetjük a membránban endogén módon kifejeződő receptorok esetleges hozzájárulását.
• Stabilitás: Ha a radioligandot hosszabb időn keresztül kell használni, a stabilitás tényező lehet az Ön számára. A 125I-jelölt ligandumokat általában a gyártási dátumtól számított egy-két hónapon belül kell felhasználni. A tritiált ligandumokat általában a gyártási dátumtól számított 3-6 hónapon belül kell felhasználni; ez alól azonban vannak kivételek. A lebomlási sebesség és a gyártási dátumok megtalálhatók a tétel-specifikus műszaki adatlapjainkon. Az egyes PerkinElmer radiokémiai szerek ajánlott felhasználási idejéről a műszaki ügyfélszolgálattal is egyeztethet – elérhetőségeinket az oldal jobb felső sarkában találja.
• Energia: A 3H béta energiát szabadít fel, amely szcintillációs számlálóval mérhető a szcintilláns hozzáadása után (szcintillációs koktél, Meltilex® szilárd szcintilláns, SPA gyöngy stb. formájában). A béta-energia a szcintillánssal kölcsönhatásba lépve fotonokat hoz létre, amelyeket a detektor mér. A 125I béta- és gammaenergiát is felszabadít. Ha csak gammamérőhöz van hozzáférése, akkor 125I-vel jelölt radioligandumot kell használnia. További tényező a vizsgálat formátuma. A 125I több béta-szerű energiát bocsát ki, mint a 3H. SPA-mérésekhez mind a 3H, mind a 125I-jelölt ligandumok hatékonyan használhatók.

A radioaktív ligandumhoz való kötődési vizsgálatokat többféle formátumban lehet elvégezni. Jellemzően szűrési formátumban végezzük ezt a vizsgálatot, de a vizsgálat SPA formátumban is elvégezhető. Az SPA formátum homogén formátum, ami azt jelenti, hogy nincs szükség mosási lépésekre. A szűrési vizsgálatban a nem kötött ligandumot vákuumszűrő vagy sejtszüretelő segítségével mossuk ki.

.based

Top

Assay Formats

Szűrési ligandumkötési próbák

Nézzen meg további információkat arról, hogy milyen anyagokra van szüksége, milyen optimalizálásokat kell esetleg elvégeznie, valamint referenciákat a radioaktív ligandumkötési szűrőlemezes próbákhoz. Szűréses formátumban a kötődési próbát először egy próbalemezben végzik el, majd egy sejtgyűjtő (vákuumos elosztó) segítségével egy filtermat- vagy UniFilter®-lemezen keresztül szűrik. A szűrőket mossuk, hogy eltávolítsuk a nem kötött radioligandumot. A filtermat- vagy UniFilter-lemezt ezután megszárítjuk, majd szcintillációs koktélt (vagy Meltilex®-t) adunk hozzá, mielőtt a megfelelő detektorral leolvassuk.

SPA ligandumkötési próbák

Nézzen meg további információkat arról, milyen anyagokra van szüksége, milyen optimalizálásokat kell esetleg elvégeznie, valamint az SPA radioligandumkötési próbák referenciáit. Az SPA formátumban a sejtmembránokat SPA gyöngyökre rögzítik. Amikor a radioligand kötődik a receptorhoz/membránhoz, a radioaktív anyag az SPA gyöngy közelébe kerül. A radioligand béta energiája kölcsönhatásba léphet a gyöngyben lévő szcintillánssal, ami mérhető jelet eredményez. A nem a sejtmembránhoz kötött radioligand nem lesz elég közel az SPA gyöngyhöz ahhoz, hogy erősen kölcsönhatásba lépjen a szcintillánssal.

A ligandkötés áttekintése

Meghatározások

• Affinitás (hatékonyság): az a szorosság, amellyel a ligand a receptorhoz kötődik. Ezt általában egyensúlyi állandóval, Kd-vel fejezik ki. Minél alacsonyabb a Kd érték, annál nagyobb az affinitás.
• Speticitás: azt írja le, hogy egy ligandum mennyire szelektív egy receptorhoz képest más hasonló receptorokhoz képest
• Kd: Az a koncentráció, ahol a receptorok 50%-át foglalja el a radioligandum

Pharmacological Classifications for Ligands

Ligandok

• Teljes agonista: olyan ligandum, amely egy receptorhoz kötődik és aktiválja azt, és maximális választ vált ki
• Részleges agonista: olyan ligandum, amely egy receptorhoz kötődik és szubmaximális választ vált ki
• Antagonista: olyan ligandum, amely egy receptorhoz kötődik, de nem aktiválja a receptort. Az antagonisták önmagukban alkalmazva nem váltanak ki választ. Egy konkurens agonista ligandum hatását blokkolják.
• Inverz agonista: olyan ligandum, amely egy receptorhoz kötődik és a választ az alapszint alá csökkenti

Vizsgálatok

I. Szaturációs kísérlet: A kötési egyensúly mérése a radioligand titrálásával, a receptor mennyiségének állandó szinten tartásával.

A telítési görbék segítségével meghatározható a Bmax (receptor expressziós szintje) és a Kd (a ligandum kötési affinitása).

Telítési kísérlet

• Teljes kötés: Növekvő radioligand koncentráció hideg ligandum hiányában. Mind a receptorhoz való specifikus kötődést, mind a nem specifikus kötődést méri.
• Nem specifikus kötődés: A radioligandum növekvő koncentrációja hideg ligandum jelenlétében. A radioligand nem receptor komponensekhez való kötődését méri.
• Specifikus kötődés: Teljes mínusz nem specifikus kötődés. A receptorhoz való specifikus kötődést méri.

II. Versenykísérlet: Egyetlen radioligand-koncentráció egyensúlyi kötődését méri különböző koncentrációjú, nem jelölt kompetitor jelenlétében.

Konkurencia-görbék segítségével nagyszámú, nem jelölt vegyület receptorhoz való affinitását határozhatja meg szűrés során. Az IC50 és Ki értékek a kompetíciós adatokból származtathatók.

Kompetíciós görbe

• IC50: a radioaktív ligandum felét kiszorító konkurens ligandum koncentrációja
• Ki: a hideg ligandum affinitása a receptorhoz

Megjegyzés: a radioligandum koncentrációjának változtatásakor a referencia vegyület IC50 értékének eltolódása figyelhető meg; a Ki azonban változatlan marad.

III. Kinetikai kísérletek: Mérje a kötődés mértékét különböző időpontokban, hogy meghatározhassa a radioligandum asszociációjának és disszociációjának sebességi állandóit.

Kinetika

• Telített koncentrációjú ligandumot adtak hozzá egy időben megkötött mennyiséget a Kon
• Magas koncentrációjú, nem jelölt versenytársat adtak hozzá. és a kötődés idővel mért csökkenése a Koff

Top

Tippek és GYIK

meghatározásához, olyan radioligandumot szeretne választani, amely a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

• magas specifikus aktivitás (> 20 Ci/mmol egy tritiált ligandum esetében)
• alacsony nem specifikus kötődés (a hidrofób ligandumok általában magasabb nem specifikus kötődést mutatnak)
• magas tisztaság (általában > 90%-os tisztaság)
• magas szelektivitás
• stabilitás (ha a radioligandumot hosszabb időn keresztül kell használni, a stabilitás tényező lehet. A 125I-jelölt ligandumokat általában a gyártástól számított egy-két hónapon belül fel kell használni. A tritált ligandumokat általában a gyártási dátumtól számított 3-6 hónapon belül kell felhasználni (ez alól azonban vannak kivételek).

Az adatok ábrázolásakor javasoljuk, hogy a radioligandum munkaoldatainak kísérletileg meghatározott koncentrációját használja, ne pedig a számított koncentrációt. Egyes radioligandok megtapadnak a hígítócsövek falán. Fontos, hogy meghatározza a pipettázott radioligand valódi koncentrációját. A radioligand hígítás koncentrációjának kísérleti meghatározásához pipettázzon ki néhány mikrolitert a hígítócsőből, és helyezze egy szűrő alátétre. Érdemes lehet ennek a mintának egy 1/10-es hígítását is spotolni, hogy ellenőrizni tudja az eredményeit. Határozza meg a dpms-t (percenkénti dezintegráció). Számítsa át a dpms-ről Curie-re a következő egyenlet segítségével:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Ezután használja a radioaktív anyagtételének fajlagos aktivitását a Curie-ről molra történő átváltáshoz. A radioaktív koncentráció meghatározásához ezen a ponton ossza el a mólok számát azzal a térfogattal, amelyet a szűrőmatracon megpöttyözött.

Kérdések

Q. Milyen koncentrációjú radioligandumot használjak a telítési görbéhez?
A. Általában azt javasoljuk, hogy 3-5 koncentrációt válasszon a Kd alatt, és 3-5 koncentrációt a Kd felett. A legmagasabb koncentrációnak a Kd tízszeresének kell lennie.

Q.Milyen koncentrációjú radioligandumot kell választani a kompetitív kötődéshez?
A. A radioligandot alacsony koncentrációban használjuk, általában a Kd-értékénél vagy az alatt. Ha a specifikus aktivitás alacsony, a Kd-érték feletti koncentráció is használható, de soha nem lehet a telítő koncentrációnál nagyobb vagy annál nagyobb.

Q. Milyen típusú ligandumot használjak a nem specifikus kötődés meghatározásához a telítési görbékben?
A. Általában olyan ligandumot kell választani, amely különbözik a radioligandtól. Csak a radioligand receptorhoz való specifikus kötődését akarja kiszorítani. Olyan ligandumot kell választania, amely nagy affinitással rendelkezik a receptor kötőhelyéhez és alacsony affinitással a nem specifikus kötőhelyekhez.

Top

Más PerkinElmer receptor-ligand kötési technológiák

• DELFIA fluoreszcens receptor-ligand kötési próbák

Top

Egyedi radiokémiai vizsgálatok, sejtvonalak, Membránok, fagyasztott sejtek és receptorok

A PerkinElmer egyedi radiokémiai anyagokat, egyedi sejtvonalakat és membránokat, egyedi mikrolemezeket, SPA gyöngyöket és FlashPlate-eket, valamint egyedi tesztfejlesztést kínál. Ha egyéni szolgáltatások iránt érdeklődik, kérjük, vegye fel a kapcsolatot egyéni csapatainkkal:

ON>POINT® Custom Assay Development Services

Top

Top