Eredmények és vita
A transzkripciós faktor NF-κB szubsztitúciós aktivációját alapvető fontosságúnak tartják a t(11;18) transzlokációval rendelkező MALT-limfómák API2-MALT1 fúziós fehérjéje általi B-sejtes transzformációhoz. Az API2-MALT1 293T sejtekben történő tranziens overexpressziója egy NF-κB luciferáz riporter gén erőteljes aktiválódását eredményezi , ezáltal hasznos modellrendszert biztosít az API2-MALT1 NF-κB felé történő jelzési mechanizmusainak tanulmányozására. A transzfekció hatékonyságának nyomon követése érdekében számos kísérletben pEGFP-N2 (Clontech) koexpresszáltunk. Meglepetésünkre megfigyeltük, hogy az EGFP dózisfüggő módon gátolta az API2-MALT1 által indukált NF-κB aktivációt (1A. ábra). Ezzel szemben az EGFP nem befolyásolta az NF-κB p50/p65 alegységeinek expressziója által indukált riporteraktivációt (1B ábra), ami arra utal, hogy az API2-MALT1 által aktivált NF-κB jelátviteli kaszkádba való beavatkozás az NF-κB upstream irányába történik.
- PowerPoint dia
- nagyobb kép
- eredeti kép
(A) Az NF-κB luciferáz riporter aktiválását Flag-tagged API2-MALT1 fúziós fehérje által az EGFP dózisfüggő módon gátolja.
(B) Az EGFP nem gátolja az NF-κB p50/p65 alegységeinek expressziója által indukált NF-κB függő luciferáz aktivitást (C) Az NF-κB luciferáz riporter aktiválása Flag-API2-ALT-MALT által.MALT1 által kiváltott aktivációt gátolja a TRAF6 kötőmotívumra mutált EGFP (D) Az EGFP, de nem a pmaxGFP megakadályozza az NF-κB luciferáz riporter TNF-α által indukált aktiválódását, valamint az IκB-α és a JUN foszforilációját 293T sejtekben.
Az EGFP nem növeli a HSP70 szintjét és nem indukálja a HSP70B′-t 293T sejtekben.
Az EGFP és a pmaxGFP fluoreszcencia-intenzitása (Ex485/Em520nm) egyaránt ∼100-szorosa volt a háttérnek. (E) Az N- és/vagy C-terminális EGFP fúziós fehérjék (API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actin, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) vagy β-Tubulin esetében) és a nukleáris lokalizációs jellel (NLS) vagy farnisilációs hellyel ellátott EGFP (pEGFP-F) csökkenti a TNF-α-indukált NF-κB luciferáz riporter aktivitást 293T sejtekben. Alul: Emberben a HSP70 normális körülmények között konstitutívan expresszálódik, de a Hsp70B′ csak stressz hatására indukálódik.
A Hsp70B′-nek nincs bazális expressziója.
A HSP70B′ expressziójának pozitív kontrolljaként 293T sejteket (2. sáv) két órán keresztül 44°C-on hősokkoltunk (3. sáv), majd a betakarítás előtt 5 (4. sáv) vagy 18 (5. sáv) órán keresztül 37°C-on hagytuk regenerálódni. Az NF-κB-függő luciferáz-aktivitást minden kísérlet esetében a vektor transzfektált sejtek indukciójának szorzataként, grafikusan pedig legalább három független kísérlet átlagaként és standard eltéréseként ábrázoljuk.
Minden molekulatömeg-standard kDa-ban van megadva.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
A MALT1 az antigén-receptor útvonal alapvető jelátviteli összetevője az NF-κB felé , . Úgy gondolják, hogy a BCL10 közvetíti a MALT1 oligomerizációját, ami lehetővé teszi a TRAF6-tal való komplexképzést. A TRAF6 oligomerizációja kiváltja a RING domén E3 ubikvitin ligáz aktivitását, ami az IKKγ (NEMO) Lys63-kötésű poliubikvitin láncokon keresztül történő módosítását eredményezi. Ez ezután megkönnyíti az IKKγ kölcsönhatását a TGFβ aktiváló kináz 1 (TAK1), amely az IKKβ foszforilációján keresztül teljes mértékben aktiválja az IκB kináz komplexet (IKK), ami az NF-κB aktiválásához vezet. Hasonlóképpen, az API2-MALT1 fúziós fehérje az NF-κB-t az IKKγ TRAF6 által közvetített poliubikvitinációján keresztül aktiválja. A TRAF6 kölcsönhatása a MALT1 karboxi-terminusával két potenciális TRAF6-kötő motívumon keresztül történik (PxExxAr/Ac, ahol az Ar/Ac egy aromás vagy savas maradékot jelent . Az EGFP szekvencia vizsgálata kimutatta egy TRAF6-kötő konszenzus jelenlétét (PNEKRD, AA 212-217). Az EGFP kristályszerkezete azt mutatja, hogy a PNEKRD-motívum egy hurokban, két béta-lemez között helyezkedik el, ami arra utal, hogy az EGFP elérhető, és a TRAF6 szekvenálásán keresztül negatív szabályozó szerepet játszik. A co-IP kísérletek azonban nem mutattak ki kölcsönhatást az EGFP és a TRAF6 között (az adatok nem láthatóak), és a TRAF6-kötési konszenzus mutánsai ugyanolyan hatékonyan blokkolták az NF-κB API2-MALT1 általi aktiválását, mint az EGFP (1C ábra).
Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a hatás az API2-MALT1-re korlátozódik-e, elemeztük a TNF-α által indukált NF-κB aktivációt az EGFP-t expresszáló 293T sejtekben. Az EGFP ismét csökkentette az NF-κB jelátvitelt, amit az alacsonyabb riporter aktivitás és az NF-κB inhibitor, az IκB-α csökkent foszforilációja mutatott (1D ábra). Ezután azt vizsgáltuk, hogy az EGFP fúziós fehérjéknek lehet-e ugyanez a hatása. Mind az N-, mind a C-terminális EGFP-fúziók blokkolták az API2-MALT1- (adat nem látható) és a TNFα által kiváltott NF-κB aktivációt (1E ábra). Az NF-κB útvonal aktiválása mellett a TNF-α kezelés a JNK jelátvitelt is beindítja. A JUN foszforilációja, amely az aktivált JNK jelátvitelre utal, szintén csökken az EGFP hatására TNF-α kezelés után (1D ábra).
Beszámoltak arról, hogy a GFP-t expresszáló sejtek hosszan tartó vizualizációja reaktív oxigénfajok termelését indukálja, ami élettani változásokat és végül sejthalált eredményezhet . Érdekes módon mindkét EGFP mutáns a TRAF6 kötődési konszenzus tekintetében elvesztette zöld fluoreszcenciáját, de hatékonyan gátolta az NF-κB jelátvitelt (1C ábra). Továbbá a pmaxGFP (Amaxa Biosystems), egy szerkezetileg eltérő fluoreszcens fehérje nem befolyásolta az NF-κB és a JNK aktiválódását TNF-α kezelés hatására (1D ábra), ami arra utal, hogy a gátlás nem a szabadgyökökkel kapcsolatos fototoxicitás eredménye. Egy másik tanulmány szerint az EGFP magas szintje képes a 70-es hősokkfehérjét (HSP70) indukálni, amely az IKKγ-vel és a TRAF6-al való kölcsönhatásán keresztül képes gátolni az NF-κB aktiválódását. A HSP70 indukciója azonban az endotélsejtekre korlátozódott, és nem tapasztaltunk megnövekedett HSP70-szintet vagy a HSP70B′ indukcióját EGFP-t expresszáló 293T sejtekben (1D-E ábra).
Az API2-MALT1 expresszió vagy TNF-α kezelés hatására bekövetkező NF-κB aktiváció az IKKγ Lys63-kötésű poliubikvitinnel történő módosításához kapcsolódik a TRAF6, illetve a TRAF2 által . Továbbá a TNFα által indukált JNK szignálhoz TRAF2 auto-ubikvitinációra van szükség . Az EGFP-nek a TRAF6 vagy a TRAF2 RING E3 ubikvitin ligáz aktivitására gyakorolt lehetséges hatásának felmérése érdekében az ubikvitinációt egy olyan HA-jelölt ubikvitin-mutáns segítségével követtük nyomon, amelyben csak a Lys63 áll rendelkezésre a polimerizációhoz (HA-Ub-K63). Az API2-MALT1 expressziója vagy a TNF-α stimuláció növelte a poliubikvitinált fehérjék szintjét 293T sejtekben, és az immunprecipitátumokban fokozott IKKγ poliubikvitinációval járt együtt, és mindkét folyamatot blokkolta az EGFP (2A ábra, 1,2,5,6. sáv). Ezenkívül az EGFP csökkentette a K63-hoz kötött poliubikvitináció alapszintjét 293T sejtekben (2A ábra, 3. és 4. sáv). Hasonlóképpen, az API2-MALT1 expressziója vagy a TNFα kezelés serkenti a K48-hez kötött ubikvitin láncok összeállását, amit ismét blokkol az EGFP és annak strukturális homológja, a dsRed (Clontech), de nem a pmaxGFP (2B ábra).
- PowerPoint dia
- nagyobb kép
- eredeti kép
(A) A jelzett konstrukciókkal transzfektált és 4 órán keresztül 20 ng/ml TNF-α-val kezelt 293T sejteket (5. és 6. sáv) anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) és anti-EGFP antitestekkel immunoblottoltuk (bal oldali panel), illetve az anti-IKKγ immunprecipitátumokat anti-Flag (IKKγ) vagy anti-HA (ubikvitin) antitestekkel immunoblottoltuk (jobb oldali panel).
(B) Az EGFP befolyásolja a K48-hoz kötött poliubikvitinációt.
293T sejteket transzfektáltunk egy olyan Ubiquitin konstrukcióval, amelyben csak a Lys48 áll rendelkezésre a polimerizációhoz (HA-Ub-K48), 4 órán át kezeltük 20 ng/ml TNF-α-val vagy kezeletlenül hagytuk, és a sejtlizátumokat anti-HA (Ub-K48) és anti-EGFP antitestekkel immunoblotoztuk.
Az EGFP és a pmaxGFP fluoreszcencia-intenzitása (gerjesztés 485/Emisszió 520 nm) hasonló volt (∼100-szorosa a háttérértékeknek), a pDs-Red expresszióját fluoreszcens mikroszkópiával igazoltuk.
(C) Az EGFP stabilizálja az exogén API2-Myc-et 293T sejtekben a Lys48-hoz kötött auto-ubikvitináció és a proteaszomális degradáció csökkentése révén.
(D) Az EGFP stabil expressziója a merkelsejtes karcinóma MCC14 sejtvonalában.2 csökkenti a poliubikvitinációt és növeli az endogén p53 expressziós szintjét.
A p53 és az aktin jelek átlagos arányát és standard eltérését adjuk meg (három független kísérlet), (Ub)n : poliubikvitinált fehérjék.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Hogy megvizsgáljuk, hogy az EGFP kizárólag a TRAF fehérjék ubikvitinációját befolyásolja-e, az API2-t, egy RING E3 ubikvitin ligázt vizsgáltuk, amely Lys48-hoz kötött auto-ubikvitináción keresztül destabilizálja magát . Az EGFP együttes expressziója gátolta az API2 által indukált poliubikvitinációt 293T sejtekben, ami az API2 expressziós szintjének növekedését eredményezte (2C ábra). Az EGFP-t stabilan expresszáló MCC14.2 sejtekben is megfigyelhető volt az ubikvitináció csökkent steady-state szintje. Ennek következtében az EGFP-t expresszáló sejtekben az endogén p53 alapszintje, amelyet az MDM2 Lys48-hoz kötött ubikvitinációja révén szorosan szabályoz, enyhén megnövekedett (2D ábra).
A következőkben azt vizsgáltuk, hogy az EGFP befolyásolja-e az ubikvitinációt in vivo. A poliubikvitináció bazális szintje csökkent az EGFP transzgénikus egerekből származó lépi limfocitákban , ami az antigén stimulációt követően az IκB-α foszforilációjának csökkenésével járt együtt a kontroll egerekhez képest, ami arra utal, hogy az EGFP csökkenti a B-sejt receptorok által kiváltott NF-κB aktivációt (3A-B ábra). Az API2-MALT1 transzgénikus egerek csontvelőjében B220+/CD40+ B-sejtek hiányoznak, mivel az API2-MALT1 által közvetített NF-κB aktiváció felgyorsítja a naiv B-sejtekké érésüket. Amikor ezeket az API2-MALT1 transzgenikus egereket EGFP egerekkel kereszteztük, az EGFP/API2-MALT1 kettős transzgenikus egerek csontvelőjében a B220+/CD40+ B-sejtek hiánya helyreállt (3C ábra), ami tovább erősíti az ubikvitinációra és az NF-κB jelátvitelre gyakorolt in vivo hatást. Hasonlóképpen, a poliubikvitináció csökkent az EGFP egerek májsejtjeiben, és a p53 stabilizációjával járt együtt, amit az expressziós szintjének növekedése mutatott (3A, D ábra). A p53 fő célgénje a májban a γ-sugárzás által kiváltott DNS-károsodás esetén a p21, amely a sejtciklus leállásához és a DNS-javításhoz szükséges. Ennek megfelelően a γ-sugárzás által kiváltott DNS-károsodás nemcsak nagyobb p53-választ okozott az EGFP egerekben, hanem a p21 indukciója is enyhén fokozódott (3D ábra). Végül in vitro kísérleteket végeztünk annak értékelésére, hogy az EGFP közvetlenül befolyásolja-e az ubikvitin láncok összeállását; azonban a rekombináns EGFP nem befolyásolta egy kontroll szubsztrát poliubikvitinációját (3E ábra), ami arra utal, hogy az EGFP ubikvitinációra gyakorolt hatása a sejtkörnyezettől függ.
- PowerPoint dia
- nagyobb kép
- eredeti kép
(A) FVB vad típusú (wt) és EGFP transzgenikus egerek lép- és májkivonatainak Western blotjai, amelyeket Ubiquitin, EGFP és aktin (terhelő kontroll) elleni antitestekkel detektáltak.
(B) Az EGFP csökkenti az IκB-α foszforilációját az EGFP egerekből tisztított anti-IgM/anti-CD40 stimulált B-limfocitákban.
A kísérleteket három példányban végeztük, egy kísérlet reprezentatív képe látható.
Az IκB-α-P és az aktin arányának átlaga és szórásai a nem stimulált sejtekhez képest.
(C) Az API2-MALT1 egerek csontvelőjében a B220+/CD40+ B-sejtek deficitje helyreáll az EGFP/API2-MALT1 kettős transzgenikus egerekben.
Három példányban végzett kísérletek, az átlag és a standard eltérések ábrázolva. eMalt1: endogén Malt1, *a-specifikus sáv (D) Az EGFP egerek megnövekedett p53 szintet mutatnak a májban, és fokozott p53/p21 választ mutatnak γ-sugárzás indukálta DNS-károsodásra.
A p53/p21 és az aktin jelek arányának átlaga és szórásai az 1. mintához viszonyítva.
(E) A rekombináns EGFP (rEGFP) nem akadályozza meg a biotin-lizozim szubsztrát poliubikvitinációját in vitro. (Ub)n: poliubikvitinált fehérjék.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
Végeredményben adataink azt mutatják, hogy az EGFP és az EGFP fúziós fehérjék befolyásolják a RING E3 ubikvitin ligáz-függő folyamatokat, mint az NF-κB és JNK jelátvitelt vagy a p53 homeosztázist sejtvonalakban és egerekben. Az NF-κB központi szerepet játszik különböző biológiai folyamatok szabályozásában, beleértve a veleszületett és adaptív immunitást, a fejlődést, a sejtnövekedést és a túlélést . A túlélést elősegítő jelek az apoptózist gátlók, például a B-sejtes leukémia/limfóma-XL emelkedett expressziójából erednek. Ezért az EGFP által a sejtekben vagy az egerek agyának motoros kéregében és striatumában kiváltott apoptózis növekedése összefügghet az NF-κB csökkent aktivitásával, amely az upstream szabályozóinak hibás poliubikvitinációja és aktiválása/lebontása miatt következik be. A hibás ubikvitináció feltehetően a végtagövi izomdisztrófiát is okozza, amely a Trim32, az aktin ubikvitin ligázának mutációihoz társul. Mivel kimutatták, hogy az EGFP károsítja az aktin-myozin kölcsönhatásokat az izomsejtekben, és tágult kardiomiopátiát idéz elő EGFP egerekben , csábító a feltételezés, hogy az aktin ubikvitinációja alapvető szerepet játszhat az izom normál működésében, és hogy az EGFP általi deregulációja okozza a fent említett fenotípusokat. Ezért, tekintettel az ubikvitináció számos sejtfolyamatban betöltött szerepére, az EGFP élősejt-riporterként való használatát alaposan meg kell fontolni.
Vélemény, hozzászólás?