Az oxidatív-fermentatív (OF) tesztet Hugh és Leifson fejlesztette ki 1953-ban. Ők fejlesztették ki az OF táptalajt, hogy különbséget tegyenek az oxidatív baktériumok (amelyek csak aerob körülmények között termelnek savat a szénhidrátokból) és a fermentatív baktériumok (amelyek aerob és anaerob körülmények között is termelnek savat) között.
A szacharolitikus mikroorganizmusok a glükózt fermentatív vagy oxidatív módon bontják le. A fermentáció végtermékei viszonylag erős vegyes savak, amelyek hagyományos fermentációs tesztközegben kimutathatók. A glükóz oxidatív lebontása során képződő savak azonban rendkívül gyengék és kisebbek, ezért a kimutatáshoz a Hugh és Leifson-féle OF-közeg érzékenyebb oxidációs fermentációs közegére van szükség. A táptalajt úgy készítették el, hogy a glükóz mennyiségét a fermentáció kimutatására használt táptalajban található mennyiség fölé emelték, a pepton mennyiségét pedig csökkentették.
A Hugh és Leifson-féle OF-közeg a következőképpen különbözik a szénhidrátos fermentációs közegtől:
- Az agar koncentrációja 3%-ról 2%-ra csökken, így az állaga félig szilárd (Ez segíti a szervezet mozgékonyságának meghatározását).
- A pepton koncentrációja 11%-ról 2%-ra csökken. (csökken a pepton anyagcseréje során keletkező lúgos termék mennyisége; ezzel csökkentve ezen termékek semlegesítő hatását).
- A szénhidrátkoncentrációt 0,5%-ról 1-re növeljük.0% (A glükóz megnövelt koncentrációja a közegben fokozza e gyenge savak termelését olyan szintre, amely a bromtimolkék indikátorral kimutatható.)
Elv:
Az oxidatív-fermentatív teszt azt határozza meg, hogy bizonyos gram-negatív pálcikák fermentációval vagy aerob légzéssel (oxidatív módon) metabolizálják-e a glükózt. Az anaerob fermentációs folyamat során a piruvát az erjedés típusától függően különböző vegyes savakká alakul át. A fermentáció során keletkező savak magas koncentrációja oxigén jelenlétében vagy hiányában zöldről sárgára változtatja a brómtimol-kék indikátort az OF közegben .
Egyes nem fermentáló gram-negatív baktériumok a glükózt aerob légzéssel metabolizálják, ezért a glikolízis és a Krebs-ciklus során csak kis mennyiségű gyenge savakat termelnek. A pepton mennyiségének csökkenése és a glükóz mennyiségének növekedése megkönnyíti az így keletkező gyenge savak kimutatását. A savak kimutatásának további elősegítése érdekében dikálium-foszfát puffert adunk hozzá.
Használatok:
AOF teszt annak meghatározására szolgál, hogy a gram-negatív baktériumok oxidatív módon, fermentáció útján metabolizálják-e a szénhidrátokat, vagy nem szachrolitikusak (nem képesek felhasználni a közegben lévő szénhidrátot).
Médium:
Hugh és Leifson OF bázismédiuma; az összetevők a következők:
- Nátrium-klorid : 5,0 g
- Di-kálium-foszfát : 0,3 g
- Pepton : 2 db.0 g
- Bromtimolkék : 0,03 g
- Agar : 3,0 g
- Glükóz : 10 g
- Víz : 1000 ml
A pH-t autoklávozás előtt 7,1-re kell beállítani. Miután a táptalajt 15 percig 121°C-on autoklávoztuk, aszeptikusan 10%-os szénhidrátoldat szűrt, sterilizált oldatát adjuk a táptalajhoz 1%-os végső koncentrációig.
Eljárás
- Inokuláljunk két cső OF táptalajt a vizsgált organizmussal egy egyenes drót segítségével a cső “félig az aljáig” szúrva.
- Fedjük le mindkét pár egyik csövét 1 cm-es réteg steril ásványi olajjal vagy folyékony paraffinnal (ez anaerob állapotot teremt a csőben azáltal, hogy megakadályozza az oxigén diffúzióját), a másik csövet hagyjuk nyitva a levegő számára.
- Inkubáljuk mindkét csövet 35°C-on 48 órán át (a lassan növekvő baktériumoknak 3-4 napra is szükségük lehet az eredmények megfigyeléséhez)
Interpretáció
A savtermelés a közegben a sárga szín megjelenésével mutatható ki. Oxidatív organizmusok esetében; a színtermelést először a közeg felszíne közelében lehet észlelni.
A következők a reakcióminták:
- Fermentatív eredmény: Savtermelés mindkét (nyitott és fedett) csőben. A keletkező sav zöldről sárgára változtatja a pH-indikátort, a bromtimolkéket. pl. Escherichia coli
- Oxidatív eredmény: A savtermelés a nyitott csőben (aerob) és nem az olajjal fedett csőben (anaerob) oxidatív eredményt jelez. A glükózt oxidatív anyagcserével metabolizáló, nem erjesztő baktériumok oxidatív eredményt adnak. pl. Pseudomonas aeruginosa
- Nem szacharolitikus (negatív OF eredmény): A nem szachrolitikus baktériumok negatív OF-eredményt adnak. A negatív eredményt az jelzi, hogy az olajjal fedett csőben nincs színváltozás, és néhány esetben a pH emelkedése (pH 7,6) a nyitott cső tetején a bromtimolkék zöldről kékre változik. A pH-érték növekedése a közegben lévő peptont (fehérjét) lebontó baktériumok amintermelésének köszönhető.
pl. Alcaligenes faecalis.
minőségi ellenőrzés
- Glükóz fermentor: Escherichia coli
- Glükózoxidáló: Pseudomonas aeruginosa
- Nem szacharolitikus: Moraxella species
Vélemény, hozzászólás?